基于分子对接模型解析鲜味肽呈鲜差异的高级构象特征

Umami peptide is a typical green and safe protein flavor enhancer in food. It is a key issue to obtain new umami peptides for the further development of the industry of protein flavor enhancer. However, the related researches about umami peptides has been focusing on the enzymatic abstraction, Maillard reaction and the identification of the peptide amino acid sequences up to now, due to the deficiency of traditional methods in this field. Therefore, new method adopted to reveal the structural features of umami peptides is one of the important scientific issues. Based on the pre-research foundation of flavor peptides, protein expression and bioinformation, this project chooses the food source umami peptide (KGDEESLA), and its derivative library that possesses different sequence length, to study the structural features of umami peptides, in which a new strategy of combination of molecular docking is creatively employed. This research will be systematically carried out with the homology modeling to predict the structural conformations of umami peptides, molecular docking of the umami peptides and their receptors (T1R1+T1R3 dimer) to analyze the key residues, rational design based on the resultant model by molecular docking, gene cloning and expression, and sensory evaluation to verify the influence on the umami of the umami peptides. Our results are expected to elucidate the structural features of umami peptides, and provide scientific basis and methodical reference for the structural and functional researches of other flavor peptides.

鲜味肽是新一代“绿色、安全”的食品蛋白鲜味剂。获得新型鲜味肽是目前蛋白鲜味剂进一步发展的核心关键，但受传统实验方法的限制，相关研究多侧重于酶解提取、美拉德反应和肽序列鉴定等，因而结合新的方法解析鲜味肽影响鲜味的高级构象特征，是当前设计并获取新型鲜味肽亟待解决的重要科学问题之一。本项目在风味肽、蛋白表达和生物信息学的预研基础上，以食品源鲜味肽（KGDEESLA）及以其为基础构建的长度不同的序列库为研究对象，创新性地采用融合分子对接和实验验证的策略，系统开展：同源建模预测鲜味肽的高级构象，然后将其与鲜味受体（T1R1+T1R3二聚体等）分子对接研究鲜味肽呈鲜功能差异的关键氨基酸残基，最后基于分子对接模型理性设计、克隆表达及感官评价实验验证鲜味肽高级构象对鲜味的影响。预期成果有望揭示鲜味肽呈鲜功能差异的高级构象特征，为更深入地研究鲜味肽及其它风味肽结构与功能的关系提供新的材料和方法学参考。

鲜味肽作为新一代“绿色、安全”的肽类呈鲜物质，在调味料领域极具开发潜力。本项目依据分子模拟高级构象、分子对接、克隆表达和发酵放大思路，探索鲜味肽呈鲜差异的高极构象特征，主要结果如下：.1. 将罗非鱼解酶、分离纯化、质谱分析，鉴定获得了一种新型的鲜味肽序列（OSP，KGSLAEEE）。经美拉德反应和感官评价，表明该鲜味肽有一定的鲜味。.2. 将上述OSP、牛肉鲜味肽（BMP）和大豆鲜味肽（SUP），采用PEP-FOLD3折叠工具结合NAMD优化预测其配体3D高级构象。在蛋白质数据库中搜索鲜味受体-钙敏感受体CaSR，采用Modeller结合NAMD优化构建受体3D高级构象。.3. 采用Autodock vina、Discovery Studio 4.5将鲜味肽及其受体分子对接。分析对接模型中鲜味肽同受体的相互作用，进一步分析鲜味肽呈鲜差异的高级构象特征，即鲜味受体上存在若干关键的作用位点（见后），及鲜味肽构象空间大小是呈鲜差异的关键。探索分析在单倍SUP的C-端添加His标签的可行性，筛选出BMP的最佳串联倍数为8倍、OSP的最佳串联倍数为8倍、SUP最佳串联倍数为10倍等。.4. 鲜味肽属于食品添加剂，对食品安全性要求相对严格。首次采用食品安全的表达宿主Bacillus subtilis进行表达，首次采用密度依赖型启动子PsrfA进行无添加剂自诱导表达系统表达，确保微生物法制备鲜味肽的食品安全性。成功构建了鲜味肽（8BMP、SUP、10SUP和8OSP）重组表达工程菌：B. subtilis 168/PMA09srfA-8BMP、B. subtilis 168/PMA09srfA-SUP、B. subtilis WB800/PMA09-10SUP以及B. subtilis 168/PMA09srfA-8OSP。表达的鲜味肽经感官评价后确定皆有鲜味，能提升肉汤的鲜味，且部分经美拉德反应后效果良好。该结果表明前期基于分子对接模型，探索鲜味肽呈鲜差异高级构象特征的分析是合理的。.5. 在分批发酵基础上，分别采用指数流加补料策略和基于庞特里阿金极大值原理优化的指数流加补料策略对B. subtilis 168/PMA09srfA-8BMP发酵进行控制，使鲜味肽产量提升明显。为微生物法发酵生产鲜味肽提供有益的借鉴。