基于适配子的新型海产品贝毒素无毒同步检测技术研究

全球气温变暖，海洋贝毒素引发的海产品食物中毒及公共安全事件不断增多，贝毒检测已成为海产食品卫生必检项目之一。目前采用鼠生物法、HPLC/MS联用法及免疫学方法中，均大量使用毒素标准品，检测成本高，对健康及环境不利。本项目依据独特型抗体Ab2β具有抗原内影像关系，可替代抗原；核酸适配子可与靶物质特异性结合理论，拟以获得的大田软海绵酸（OA）、石房蛤毒素（STX）、短裸甲藻毒素（BTX）单抗为靶标，利用SELEX技术从随机ssDNA文库中筛选具有Ab2β功能的适配子，并连接获得串联适配子。以单抗作为捕获分子，以适配子作为检测分子，利用生物素与酶标亲和素系统，探索建立3种贝毒的无毒检测及同步检测技术，解决使用毒素标准品带来的不利影响。为建立无毒、实用的贝毒检测技术提供实验基础，并为开发利用适配子建立贝毒传感器等先进技术开僻新的思路，对食品和环境中其他污染物无毒检测也具有一定的推广意义和参考价值。

全球气候变暖，水体富营养化及过度的海产养殖导致赤潮与藻（水）华的频发，海洋贝毒素引发的海产品食物中毒及公共安全事件不断增多，严重威胁到人们的身体健康和对海产品的开发利用，已成为公共卫生领域和进出口检验检疫工作中一项值得关注的重大问题。目前采用的鼠生物法、HPLC/MS联用法及免疫学方法中，均大量使用毒素标准品，检测成本高，对健康及环境不利。解决这一问题的关键就是在方法中避免使用或少使用毒素标准品，开发无毒检测技术。本项目依据核酸适配子可以与靶物质特异性结合而替代抗体；独特型抗体Ab2β具有抗原内影像关系，可替代抗原的理论，体外合成随机ssDNA文库，分别以大田软海绵酸（OA）、石房蛤毒素（STX）、短裸甲藻毒素（BTX）及它们的单抗分别作为靶标，利用指数富集配体的系统进化（SELEX)技术筛选毒素适配子及具有抗原内影像功能的适配子，探索无毒检测的新模式。以毒素与蛋白质的偶联物作为毒素适配子筛选的靶标；以抗体F(ab′)2片段和完整抗体作为毒素内影像适配子筛选的靶标。先后设计两个文库，利用微孔板及磁珠SELEX，对3种毒素6个靶标，通过多轮筛选，大量的克隆扩增，序列测定分析与结构预测，获得针对各自靶物质的核酸序列，对获得的序列采用直接ELOSA和间接竞争ELOSA方法测定其结合与竞争活性，获得优势适配子。利用毒素抗体做固相抗原，捕获毒素，再加入内影像适配子，利用生物素-亲和素-辣根过氧化物酶显色系统，建立抗体与适配子混合无毒检测方法；将氨基化的毒素内影像适配子与固相磁珠共价结合，加入预先孵育的单抗与待检样品，通过磁性分离、底物显色建立基于内影像适配子的磁珠检测方法；利用生物素标记的毒素适配子与固定的互补探针杂交，通过毒素与其适配子结合诱导毒素适配子与固定探针变构解离，通过显色建立基于毒素适配子的微孔板和磁珠无毒检测模式；以偶联蛋白作为固相抗原，以毒素适配子作为检测探针，实现基于适配子的检测方法。上述检测方法的优点是不使用或少使用毒素标准品，实现节约检测成本，安全无毒的目的；有关核酸适配子在海洋贝毒素检测中的应用，抗原内影像核酸适配子替代抗独特型抗体用于检测分析，可为建立一种更加方便、无毒、实用的贝毒无毒检测方法提供实验基础，并为开发利用适配子建立贝毒传感器等先进技术开辟新的思路，对食品和环境中有毒有害污染物快速无毒检测方法的研究也具有广泛的推广意义。