心脏CD90+CD105+细胞在大鼠心梗后慢性心功能衰竭中的应用与机制研究

Cell therapy is the important method for coronary heart disease. The selection of cells is the key to cell therapy.Our previous trials have yielded some conclusions that cardioshpere-derived cells could modify the cardiac function after acute myocardial infarction. Previous studies demonstrate that CDCs may mainly consist of CD90+CD105+cells. So this project will continue to discuss whether CD90+CD105+cells are the effective substance of CDCs and will improve heart function after heart failure resulted from myocardial infarction and will talk about its mechanisms. We will culture and augment CDCs from both human and WK rats, 1. detect elements of CDCs by flow cytometry and test related factors in conditioned media of CD90+CD105+cells;2.inject CD90+CD105+cells into left ventricular wall of rats with chronic heart failure after myocardial infarction, and observe the changes of heart function and cardiac scars 20 days later , and we will investigate the regeneration of cardiomyocytes,smooth muscle cells and endothelial cells by ELISA/ RT-PCR/Western Blot and IHC in order to explore the mechanisms of the improvement of cardiac function.

细胞种类的选择是冠心病细胞治疗的关键。前期实验表明心脏肌球细胞衍生细胞(CDCs)能够改善急性心梗后心脏功能，预实验发现CDCs主要成分可能为CD90+CD105+细胞，故本项目将继续前述课题，探讨心脏CD90+CD105+细胞是否为CDCs的主要活性成分及是否能够改善心梗后慢性心衰并探讨其机制。本项目从人和成年WK大鼠心脏组织中培养、扩增CDCs，通过（1）体外实验：①用流式细胞术检测CDCs的表面标记物；②提纯CD90+CD105+细胞，检测培养基中细胞因子；（2）体内研究：心梗后慢性心功能不全大鼠左室心肌中直接注入CD90+CD105+细胞，20天后观察治疗前后心功能和瘢痕胶原成分变化，用ELISA、RT-PCR、Western Blot、免疫染色等检测直接和间接再生心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞情况，从而探讨功能改善的相关机制。

在心脏疾病，如缺血性心脏病的治疗中干细胞及其衍生物的应用是很有意义的方法之一。项目中利用磁分选法得到CD90+和CD90-CD105+CSCs直接注射在慢性心梗模型中梗死区域周围探讨CSCs中的关键细胞类型；CSCs联合血小板凝胶治疗心梗时MMP起了重要作用；根据部分研究结果和细胞治疗的某些弊端，设计了新型人工合成细胞微颗粒治疗受损心肌。.实验发现：⑴通过磁珠分选法收集CD90-和CD90+CD105+CSCs。将CD90-和CD90+CD105+CSCs的条件培养基加入NRCMs培养皿中。前者的条件培养基相比较能够明显促进心肌细胞的存活和收缩、NCRMs的增殖细胞、血管内皮细胞血管形成能力，而TUNEL阳性的死亡细胞明显较少。⑵CD90-CD105+CSCs能够分泌更多的生长因子HGF，更少的炎症因子MCP3和GM-CSF。⑶制备大鼠心梗模型，一个月后进行细胞干预。治疗6个月后CD90-CD105+CSCs治疗组LVEF值最高， CD90-CD105+CSCs明显减少心脏梗死区域纤维化，负性重塑。⑷CD90-CD105+CSCs治疗组的大鼠心脏梗死区域边缘有更多的心肌细胞和更多分裂的心肌细胞。⑸MMP广谱抑制剂GM6001能够减低CSCs和CSCs联合胶的治疗作用。⑹用PLGA包裹CSCs的条件培养基，并包裹CSCs细胞膜制成CMMP，与CSCs比较它具有类似表面标志物，有相似的VEGF、IGF-1和HGF表达量。⑺在CMMP治疗组的心梗区域T-细胞免疫反应明显减少。⑻CMMP可以明显减少梗死面积、增加梗死区域活性心肌和室壁厚度以及射血分数LVEF。.通过上述研究证明：①混合细胞CSCs中CD90-代表了前再生表型，而CD90+是前炎症表型, CD90-CD105+CSCs是CSCs治疗心梗后慢性心功能不全起作用的关键成分。②MMP在CSCs和CSCs联合胶治疗心梗中有重要的作用。③设计的CMMPs携带细胞膜和细胞分泌物，克服了一些活的干细胞治疗的局限性。这些为今后细胞治疗提供了新的思路。另外，根据实验中遇到的问题做了相应改进，并且把相关设计总结为两个发明申请，现已经得到国家知识产权局的实用新型专利授权。