新型等离子增强单分子检测体系的构建及其在循环肿瘤DNA的超高灵敏检测与分析中的应用

Circulating tumor DNA (ctDNA), as a promising tumor marker, can be applied noninvasively to early diagnosis of cancer, treatment process monitoring and so on. However, the content of ctDNA was lower in early or localized tumors, early diagnosis and treatment process monitoring was difficult. To solve this problem, this project proposes a novel plasmon enhanced single-molecule detection system for ultra-sensitive detection of ctDNA by combining single-molecule technique and DNA nanotechnology. The strategy can initiate reversible binding of the fluorescent probes through the competitive binding of ctDNA, and the single-molecule fluorescence signal can be monitored through total internal reflection microscope (TIRFM). Through the accurate spatial positioning ability of DNA origami to regulate the distance between gold nanoparticles and DNA probe, we hope the fluorescence intensity of the probe could be enhanced, and further improving the sensitivity of ctDNA detection, realizing ultrasensitive detection and analysis of ctDNA in blood samples of patients. This project is expected to establish a single-molecule detection model of ctDNA, to provide experimental guidance for the design of high efficiency detection probes, to provide new materials and techniques for cancer diagnosis and pathology research, to provide a new possibility for liquid biopsy, and will open a new avenue for single-molecule technique and DNA nanotechnology.

循环肿瘤DNA（ctDNA），作为一种非侵入式的肿瘤标志物，可无创地应用于肿瘤的早期诊断、治疗过程监测等方面。然而，ctDNA在早期或局限性肿瘤中含量较低，早期诊断及治疗过程监测困难。针对这一问题，本项目将单分子技术与DNA纳米技术相结合，提出一种新型的等离子增强单分子检测体系，以期实现ctDNA单分子水平的超高灵敏检测与分析。该方法通过ctDNA的竞争结合，触发荧光探针的可逆结合，利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行单分子荧光观测。希冀利用DNA折纸精确的空间定位能力调节纳米金颗粒和DNA探针之间的距离，增强探针的荧光强度，提高ctDNA的检测灵敏度，实现对病人血液样本中ctDNA的超高灵敏检测。本项目有望建立ctDNA的单分子检测模型，为高效检测探针的设计提供指导，为癌症的诊疗和病理学研究提供新材料和新技术，同时也为液体活检提供了一种新可能，开拓了单分子技术和DNA纳米技术的应用。

液体活检技术提供了一种非介入性，可重复取得癌症病人样本的方法，可以捕获血样中的循环肿瘤DNA及循环肿瘤细胞，实现癌症的早期诊断筛查，以及实时监测治疗情况，评估基因突变频率，判断预后。本项目在执行初期进行了大量探索，期间发现循环肿瘤细胞作为标志物进行检测效果更好。在经过对项目的实用性和原创性进行综合考量后，我们将原目标肿瘤检测物（循环肿瘤DNA）转变为循环肿瘤细胞，取得了较好的成果。现将本项目主要研究成果阐述如下：.（一）各向异性仿生DNA纳米界面捕获循环肿瘤细胞.我们设计并组装了各向异性的生物模拟纳米界面，该纳米界面可以高效地锚定在细胞膜上。这得益于框架核酸上不同的核酸适配体在异质性肿瘤细胞膜上的高效协同识别，因此能够有效地捕获上皮细胞粘附分子表达程度不同的肿瘤细胞，实现乳腺癌病人样本中循环肿瘤细胞的高效捕获。.（二）拟病毒异价磁纳米爪捕获循环肿瘤细胞.我们设计制备出一种异价态型磁性 DNA“纳米爪”结构用于乳腺癌细胞捕获，提高了三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231的捕获效率，并成功应用于临床血液样本中循环肿瘤细胞的捕获。.（三）多分支杂交链式反应（HCR）的电化学适配体传感器检测肝癌细胞.我们设计了一种基于DNA四面体和金属有机框架材料的电化学细胞传感器，实现了肝癌细胞的高灵敏检测。.（四）磷脂膜上动态DNA四面体电化学传感器.我们设计制备了一种基于磷脂膜的低吸附、抗污染、抗蛋白吸附动态界面，实现了肝癌细胞以及药物小分子在复杂样品中的检测。