ε-聚赖氨酸产生菌中一个新聚合物的代谢途径解析与调控

多聚氨基酸是一类由酸性或碱性氨基酸通过肽键均聚而成的聚合物，近年来该类物质由于其结构特殊性以及特殊的生理功能受到了广泛关注。目前，自然界发现的由微生物产生的多聚氨基酸仅有ε-聚赖氨酸（ε-PL）、γ-聚谷氨酸、藻青素三种。课题组在研究具有自主知识产权的ε-PL生产菌株Kitasatospora sp. CCTCC M205012过程中，首次发现该菌株在生产ε-PL的同时能够产生另一种新型多聚氨基酸-γ-聚二氨基丁酸（γ-PDBA）。本课题将首次探索γ-PDBA生物学合成规律，阐明γ-PDBA代谢途径，揭示ε-PL与γ-PDBA共生代谢机理，实现目的产物的有效调控与高效合成，并将揭示链霉菌产生γ-PDBA这一新物质的生物学意义，完善链霉菌代谢途径。同时，本研究将能获得一些γ-PDBA聚合机理信息，为深入探讨γ-PDBA合成方式奠定基础，具有重要的学术意义和应用价值。

本项目以ε-聚赖氨酸（ε-PL）生产菌株Steptomyces albulus PD-1为研究对象，取发酵液经过多步纯化分离及分析鉴定，得到新型聚氨基酸：聚二氨基丙酸（PDAP）。抑菌实验证实PDAP对细菌特别是酵母的抑菌效果良好，抑菌谱和ε-PL互补。通过对Steptomyces albulus PD-1的全基因组进行测序，经过比对分析，确定了负责PDAP合成的两个关键酶基因：丝氨酸脱水酶ORF1340和鸟氨酸环化酶ORF1341，将这两个酶基因克隆到表达载体pET-Duet并转化到大肠杆菌中，诱导表达后测得酶活，从而确定了PDAP的代谢途径，并由此构建了ε-PL和PDAP的合成代谢网络。并且通过测定ε-PL浓度、PDAP浓度、菌体干重、葡萄糖消耗速率、氧气消耗速率和二氧化碳生成速率等指标，构建了ε-PL和PDAP共生的代谢流计算模型，确定代谢途径各节点物质流和能量流分配关系。 课题组研究了pH、有机酸、氨基酸等对ε-PL和PDAP共生的影响，发现添加柠檬酸可显著提高ε-PL产量，抑制PDAP的合成。通过分析代谢流量的变化阐述柠檬酸调控的机理，并测定关键节点处酶活和细胞内还原力NADP+/NADPH验证。通过pH调控结合补料柠檬酸，对发酵条件进行优化，对ε-PL和PDAP的共生进行调控，增强主产物ε-PL合成能力，抑制副产物PDAP的合成，实现主产物ε-PL终浓度由29.8g/L上升至38.6g/L，副产物PDAP终浓度由13.3g/L下降至4.8g/L。本项目共获得奖励3项，发表论文10篇，授权专利7项。