PFOS通过血睾屏障诱导雄性生殖损伤及机制研究

Perfluorooctane sulfonate（PFOS）is known as a new persistent organic pollutants (POPs) and drawn growing attention in recent years. PFOS has been detected in many organisms and induce the spermatogenesis disorder. However, the mechanism is still unknown. Blood-Testis Barrier (BTB) plays a key role during spermatogenesis and is an important subject for the reproductive toxicological studies. There is little know about the role of BTB in PFOS induced reproductive toxicity. In this study, three dimensional cell culture, calcium ion switch model, genes knocking down primary Sertoli cells model, biotin tracer，luciferase reporter gene assay and instrumental analysis will be used. The changes in BTB structure and functions and the expression and location of proteins related to BTB will be estimated. Moreover, the important testicular target cells and proteins and relative signal pathways for PFOS-induced reproductive toxicity also will be evaluated. More important, the role of BTB in PFOS induced reproductive toxicity and the relative mechanisms will be extensively revealed. This study will be helpful to assessment of reproductive disorder induced by the similar compounds and development of the relative prevention strategies.

新型环境持久性有机污染物全氟辛烷磺酸/盐（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）的全球性污染问题越来越引起人们关注，其性质稳定易蓄积，可诱导雄性生殖损伤，然而相关机制目前仍不清楚。血睾屏障在精子发生中起重要作用，其结构和功能异常可导致生精障碍，是外源化学物生殖毒性研究领域的热点。作为生殖毒物，PFOS通过血睾屏障诱导雄性生殖损伤及其机制，还有待阐明。本课题拟从血睾屏障角度出发，采用立体培养、Ca2+开关模型、生物素示踪、原代支持细胞基因敲减模型、报告基因、内暴露与睾丸暴露检测等研究手段，分析PFOS对血睾屏障结构和功能的影响、探讨血睾屏障相关连接蛋白表达及定位的调控、筛选关键靶细胞和靶分子、锁定重要信号通路，系统解析PFOS通过血睾屏障诱导雄性生殖损伤的过程及其机制，为后续相关化合物生殖损伤研究及危害预防提供重要参考。

血睾屏障在维持雄性精子发生及生殖功能中起重要作用，PFOS属环境持久性有机污染物，流行病学研究发现其与雄性生殖损伤相关，但机制尚不清楚。本研究主要通过血睾屏障的角度研究PFOS诱导雄性生殖损伤效应及其相关机制。我们首先以成年雄性小鼠为对象建立了PFOS诱导的雄性生殖损伤模型，并对生殖损伤效应进行了评价。我们发现PFOS可诱导小鼠精子发生障碍，干扰雄激素分泌。在睾丸形态学分析中我们发现小鼠Sertoli细胞对PFOS毒作用较敏感，呈现显著的空泡化，生精上皮生精细胞显著退化、减少。其次，为了筛选出PFOS在睾丸内毒作用的靶细胞和靶分子。我们分别选择了小鼠生精相关细胞系GC1、GC2、MLTC1、TM4，通过细胞毒性试验发现Sertoli细胞株TM4对PFOS毒作用更为敏感。为此，进一步在原代小鼠Sertoli细胞上进行了验证，并发现Sertoli细胞上表达有PFOS相关的转运体（Oatp3）且与其毒效应相关。考虑到Sertoli细胞最为重要的一个功能是构成血睾屏障，维持正常的精子发生。因此，我们通过整体和体外水平研究了PFOS对血睾屏障功能的影响，发现PFOS可显著干扰正常的血睾屏障功能。其中构成血睾屏障的重要连接蛋白ZO1、Claudin11、Occludin、Connexin43的表达均下调，且与p38 MPAK信号通路相关，结果提示PFOS很可能通过p38 MAPK信号通路调控上述连接蛋白的表达而影响正常的血睾屏障功能。在此基础上，我们筛选了p38 MAPK信号通路下游相关的转录因子，发现ATF2被PFOS显著诱导，其靶基因MMP9的表达和活性亦显著增强且与连接蛋白表达下调密切相关。综合上述结果，我们推测PFOS很可能通过激活p38 MAPK/ATF2/MMP9信号通路下调连接蛋白ZO1、Claudin11、Occludin、Connexin43等的表达，从而导致血睾屏障结构和功能的破坏，进而影响了生精微环境的稳定并导致雄性精子发生障碍。通过本项目的研究，阐明了PFOS通过血睾屏障诱导雄性生殖损伤的相关机制，为引导环境持久性有机污染引起的雄性生殖健康危害研究和治疗提供了新的线索。