DHA修饰的PirBex的制备及其对脑缺血损伤保护和修复双重功效研究

Realistic solutions on functional protection and neurological recovery after cerebral ischemic injury are urgently needed in the world. Recent studies found that MAG, Nogo-A, and Omgp can inhibit axon regeneration, mainly by binding the paired immunoglobulin-like receptor B (PirB). In our preliminary study, we obtained soluble extracellular fragment of PirB (PirBex) via recombinant-DNA technology. PirBex is a high-affinity receptor for MAG, Nogo-A, and Omgp, which blocked the activation of endogenous PirB signaling pathway and promoted nerve regeneration in vitro. However, in vivo study of PirBex is hampered because it cannot get through the blood-brain barrier (BBB). Docosahexaenoic acid (DHA), also known as brain gold, can cross the BBB and accumulate in the brain, playing important roles in the nervous system development and brain function. Therefore, in this study, we plan to 1) prepare the DHA-PirBex through the condensation reaction between DHA and PirBex; 2) study the transport function of DHA-PirBex across the BBB; 3) research the double effects of DHA-PirBex on nurological recovery and functional protection after cerebral ischemic injury. It is a new strategy to explore and develop DHA-PirBex as a new drug for the treatment of cerebral ischemic injury.

脑缺血损伤后的保护及神经功能恢复是一个亟待解决的世界难题。近期研究发现，MAG、Nogo-A及Omgp主要通过免疫球蛋白样受体B（PirB）抑制受损神经的再生和功能恢复。前期研究中，利用基因重组技术制得可溶性PirB受体胞外段（PirBex），体外实验证实PirBex可与MAG等结合，通过阻断内源性PirB受体信号通路来促进轴突生长；但血脑屏障的存在限制了对其的在体研究。二十二碳六烯酸（DHA）又名脑黄金，能跨越血脑屏障并保护脑组织，是维系神经系统发育和正常脑功能的重要物质。因此，本项目拟：1）通过缩合反应制备DHA修饰的PirBex（DHA-PirBex）；2）探究DHA-PirBex在体跨血脑屏障转运能力；3)研究DHA-PirBex对脑缺血损伤的保护和促轴突生长的双重效用。本研究将为脑缺血损伤治疗药物的研制提供新思路，也为将DHA-PirBex开发成一种有效的新药提供科学和实验依据。

脑缺血损伤后的神经功能恢复及对神经元的保护是一个亟待解决的世界难题。现有研究表明MAG等物质可通过免疫球蛋白样受体B（PirB）抑制受损神经的再生和功能恢复。体外实验证明，原核表达PirB受体胞外段（PirBex），利用PirBex与MAG等物质结合，可促进轴突生长。但血脑屏障的存在限制了对其的在体研究。二十二碳六烯酸（DHA）又名脑黄金，能跨越血脑屏障运输，是维系神经系统发育和正常脑功能的重要物质。本研究利用DHA这种能维持神经细胞正常功能化的重要物质，通过DHA的羧基与PirBex蛋白氨基酸残基侧链上的氨基发生脱水缩合反应，经FTIR和MS表征，实现DHA对PirBex蛋白的修饰，构建得到DHA-PirBex。实验验证用于蛋白修饰的DHA不影响PirBex与MAG等物质的正常结合。OGD细胞实验表明，DHA-PirBex具有促进神经轴突生长的作用。尾静脉注射DHA修饰过的PirBex-GFP+（带有GFP标签的PirBex）后，制备脑组织冰冻切片，确定DHA可以在体跨血脑屏障转运蛋白入脑。建立MCAO模型，尾静脉注射DHA-PirBex，长期注射后发现鼠脑梗死面积有明显减少，且鼠的记忆以及空间辨别能力有提高。研究明确DHA具有跨血脑屏障转运蛋白能力，作为药物组成部分的DHA和PirBex共同促进神经轴突生长、减少脑梗死面积并提高MCAO鼠记忆和空间辨别能力（效果优于DHA或PirBex单独使用），这为治疗脑缺血损伤的研究提供了新思路，也为DHA修饰蛋白的研发及临床应用提供了科学依据。