新城疫病毒受体结合域RNA适配体的筛选及活性研究

新城疫病毒与受体的结合启动了病毒的生命循环，病毒HN蛋白上受体结合域是与靶细胞受体结合的关键活性区域，前期研究结果表明：鹅源新城疫病毒（NA-1株）可能含有不同于鸡源新城疫病毒（F48E9株）的受体结合位点，为进一步研究两株病毒受体结合域的异同，本研究拟通过SELEX技术筛选分别针对两株病毒HN蛋白受体结合域的RNA适配体，使用Biacore 3000生物大分子相互作用分析仪测定适配体与受体结合域之间的相互作用动力学常数，筛选出高亲和力、高效抑制病毒与受体结合的适配体。利用RNA适配体通过空间构型互补与靶分子结合的特性，对RNA适配体三维空间结构解析，确定新城疫病毒HN蛋白受体结合域的空间结构和活性位点，比较不同动物源性新城疫病毒受体结合域的异同，从病毒配体角度进一步研究新城疫病毒与易感细胞受体的相互作用关系，为丰富新城疫病毒与宿主细胞相互作用机制提供材料。

新城疫病毒血凝素蛋白（HN）上受体结合域是与靶细胞受体结合的关键活性区域，核酸适配体与单克隆抗体相比具有更高的分辨率，能识别配体间一个基团的细微差别，且所需的结合活性位点更小。本项目通过病毒粒子纯化、病毒HN蛋白的解离纯化、病毒HN基因酵母真核表达纯化的方法获得了6种稳定、均一的包含病毒受体结合域的靶标。设计合成了ssDNA文库，使用HAWP filter法在Pop-top上筛选针对新城疫病毒F48E9株（鸡源新城疫病毒）和NA-1株（鹅源新城疫病毒）全病毒（virus）、HN蛋白（HN）、HN表达蛋白（rHN）靶标的RNA适配体，经12轮筛选，获得了120个有效的RNA适配体。按照Zuker的最小自由能原则，通过mfold网站及结构预测软件RNA Structure Program v4.6分析适配体RNA的二级结构及序列的同源性关系，结果显示针对同一靶标的适配体可划分到3个簇（class），具有一定的同源性，Class A序列有两个外环、三个内环、三个发夹环、两个突起。Class B序列有一个外环、四个内环，二个发夹环。Class C有一个外环、一个内环、四个发夹环和一个突起，其中夹环和突起环在结合靶点是重要结合接触部位。ELISA和Dot-Blot法检测适配体特异性和亲和力试验结果显示出较高的特异性和亲和力，部分适配体能够区别不同源性的新城疫病毒。生物学活性实验结果显示，适配体FHN12-45-3能够减少4个单位的F48E9株病毒血凝效价，初步表明适配体与F48E9株病毒可能的活性作用位点在血凝素蛋白上，在鸡胚成纤维细胞培养体系中适配体FHN12-45-3能够减少84.62%的F48E9株病毒蚀斑，荧光定量RT-PCR方法检测适配体FHN12-45-3能够减少培养体系中77.73%病毒载量，表明筛选的RNA适配体在细胞水平能够有效的抑制新城疫病毒的复制。项目筛选获得的120个针对不同动物源性新城疫病毒受体结合域的RNA适配体，已经完成序列及RNA二级结构分析，同时细胞水平的生物学活性实验结果显示出良好的抑制新城疫病毒复制的活性，其作用的活性位点在新城疫病毒血凝素蛋白上。上述针对不同靶标的RNA适配体的获得为进一步研究两株病毒受体结合域的异同，从病毒配体角度进一步研究新城疫病毒与易感细胞受体的相互作用关系，为丰富新城疫病毒与宿主细胞相互作用机制提供材料。