调节性B淋巴细胞在抗CD20单抗治疗自身免疫1型糖尿病中的作用

B lymphocytes play an important role in autoimmune type 1 diabetes (T1AD) via both fluid and cellular autoimmunity. Our previous study showed that B lymphocytes depletion in hCD20NOD transgenic mice by 2H7 could delay or even reverse T1AD. Further study found that the newborn B lymphocytes with IL-10 secretion increased and could regulate proliferation of pathogentic BDC2.5 T lymphocytes. Therefore, it is necessary to further study this regulatory B lymphocytes population in T1AD. This study will use hCD20NOD transgenic mouse model. We will first identify the phenotype and function of Bregs in hCD20NOD mice. Then we will infuse Bregs into hCD20NOD mice with B lymphocytes depletion by 2H7 in vivo. We will purify primary lymphocytes, use FACS, ICC, CFSE, ELISA, LUMINEX, PCR Array, q-PCR, Western Blot, and adoptive tranfer experiment to study the mechanism of Bregs in T1AD. This will supply evidences for biotherapy of T1AD in practice in the future.

既往认为B淋巴细胞在自身免疫1型糖尿病（T1AD）中发挥重要致病作用。课题组研究显示，在拟人化小鼠中采用抗人CD20单抗类似物2H7，可在体去除B淋巴细胞以延缓并逆转T1AD，去除后新生的B淋巴细胞群具有可抑制致病性BDC2.5T淋巴细胞增殖的功能。因此推测具有免疫调节功能的调节性B淋巴细胞（Bregs）存在于其中。本课题采用hCD20NOD拟人化转基因小鼠，首先鉴定Bregs的表型及功能，然后通过2H7在体去除B淋巴细胞后，回输纯化扩增的Bregs，观察T1AD的发病率及开展机制研究。通过分离原代淋巴细胞，采用FACS、ICC、CFSE、ELISA、LUMINEX、PCR-Array、q-PCR、Western Blot、3H掺入增殖实验以及细胞过继实验等，在体内及体外多个层面研究Bregs在抗CD20单抗治疗T1AD中的作用，为优化临床治疗方案提供理论依据。

既往认为B淋巴细胞在自身免疫1型糖尿病（T1AD）中发挥重要致病作用。课题组研究显示，在拟人化小鼠中采用抗人CD20单抗类似物2H7，可在体去除B淋巴细胞以延缓并逆转T1AD，去除后新生的B淋巴细胞群具有可抑制致病性BDC2.5T淋巴细胞增殖的功能。因此推测具有免疫调节功能的调节性B淋巴细胞（Bregs）存在于其中。本课题在转基因糖尿病动物模型hCD20NOD小鼠及自身免疫糖尿病患者中同时开展了对于调节性B淋巴细胞的表型及功能研究。主要研究内容包括：1. 在糖尿病转基因小鼠hCD20NOD模型中，鉴定了具有调节功能的B淋巴细胞亚群的表型，通过多项体内过继实验，在体内进一步证实其对T淋巴细胞具有免疫调节功能。研究了去除B淋巴细胞后T淋巴细胞表型及功能的变化，通过体外流式细胞检测其亚型、T淋巴细胞增殖实验、及细胞炎症因子检测等试验，发现去除B淋巴细胞后，T淋巴各项炎症因子释放增加。此外，通过使用IL-10R抗体及IL10基因敲除小鼠的B淋巴细胞，在体外增殖实验及体内过继转移实验中，进一步证实了B淋巴细胞对于T淋巴细胞的免疫调节功能是IL10信号通路所介导。2. 为进一步验证在小鼠模型中的发现，我们采用流式细胞术，首次在大样本的自身免疫糖尿病患者中，研究其外周血B淋巴细胞亚型，发现了调节性B淋巴细胞的缺失及B淋巴细胞的亚群失衡可能导致1型糖尿病。进一步通过磁珠分选技术分选出B淋巴细胞，首次对其BCR进行高通量测序，研究其在自身免疫糖尿病中的作用机制。本研究的动物实验和人体试验相互佐证，提示具有免疫调节功能的B淋巴细胞在1型糖尿病的致病机制中有着重要作用，这为1型糖尿病的发病机制研究及临床干预治疗提供了崭新的思路。