基于CIRP对低温刺激的细胞保护作用及其调节机制研究

Cold is one of the toughest problems when people are facing ultra-cold weather, and a challenge in stockbreeding development. In our previous work, we successfully expressed CRIP both in prokaryotic system and eukaryotic system, and we have prepared monoclonal antibody that targets CIRP. Our preliminary data support the idea that CIRP can inhibit cold induced apoptosis. We propose to use Gateway method to construct a CRIP over-expression lentiviral vector and a RNA-interference lentiviral vector that causes CRIP kncodown, generating virus particles in 293FT cells. The primary rat hippocampus neurons will be isolated,cultured, and infected with these two lentiviral vectors to get CIRP overexpression and knockdown hippocampus neurons and the cell protection function of CRIP will be studied. We will inject viral particles into Cerebro-Spinal Fluid then get the rats with CRIP overexpression or knockdown in the brain.These rats will be subjected to different cold stimulation and we will test the expression level of CRIP in the brain and other physiological indicators. We can study in vivo function of CIRP in cold stimulated process. Our research aims to clarify how animals respond to cold through CIRP, and provide support to the elucidation of the molecular mechanisms of cold responses.

冷害已成为人类面对极端严寒天气及发展畜牧业颇为棘手的问题之一。前期工作中，冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）基因在原核与真核系统中获得表达，成功制备CIRP单抗，初步验证了CIRP具有抑制低温诱导的细胞凋亡作用。本研究拟利用Gateway技术构建CIRP的过表达慢病毒载体和CIRP-miRNA干扰慢病毒载体，在293FT细胞内进行包装获得病毒颗粒；通过慢病毒转染获得低表达和过表达CIRP的海马神经元，在细胞水平探讨CIRP的细胞保护作用；通过脑脊液注射慢病毒浓缩液的方法，获得CIRP在脑内广泛高表达和不表达CIRP的大鼠，通过不同强度冷刺激试验，测定脑组织中CIRP表达与相关理化指标的变化，探讨在体内条件下CIRP在冷刺激过程中对脑组织的细胞保护作用。本研究试图阐明动物机体在低温环境条件下通过CIRP实现的细胞保护作用及其调节机制，从而为揭示生物冷应激的分子机制及生物抗逆性研究奠定理论依据。

冷害已成为人类面对极端严寒天气及发展畜牧业颇为棘手的问题之一。冷诱导RNA结合蛋白（Cold inducible RNA-binding protein, CIRP）是在冷应激过程当中，被发现于哺乳动物细胞中的第一种冷休克蛋白，而且CIRP在低温下可以高效表达，这种低温下高效表达的蛋白已经被证明具有细胞保护作用，但确切的作用机制还有待阐明。在前期研究工作基础上，冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）基因在原核与真核系统中获得表达，成功制备CIRP单抗，初步验证了CIRP具有抑制低温诱导的细胞凋亡作用。本研究利用Gateway技术构建CIRP的过表达慢病毒载体和CIRP-miRNA干扰慢病毒载体，在293FT细胞内进行包装获得病毒颗粒；通过慢病毒转染获得低表达和过表达CIRP的海马神经元，在细胞水平探讨CIRP对低温刺激的细胞保护作用；通过小鼠腹腔注射重组慢病毒浓缩液的方法，获得CIRP在脑内广泛高表达和不表达CIRP的小鼠，通过不同强度冷刺激试验，测定脑组织中CIRP表达与相关理化指标的变化，探讨在体内条件下CIRP在冷刺激过程中对脑组织的细胞保护作用。经体内实验及体外实验结果表明，在不影响机体能量代谢的情况下，CIRP通过调节相关氧化还原系统，对氧自由基的产生进行抑制，直接或间接的使细胞免受氧自由基的攻击，降低神经元凋亡，进而对海马神经元起到保护作用。本研究阐明了动物机体在低温环境条件下通过CIRP实现的细胞保护作用及其调节机制，为揭示生物冷应激的分子机制及生物抗逆性研究奠定理论依据。. 在本课题的资助下，在国内外发表学术论文12篇，其中发表北大中文核心期刊论文11篇（10篇第一标注），发表学术会议论文15篇(4篇第一标注)；获国家发明专利1项；获黑龙江省人民政府自然科学三等奖和黑龙江省教育厅高校自然科学二等奖各1项；在全国性学术会议上做专题报告1次，会议分组报告2次，墙报展示4份；培养硕士研究生7名，进站博士后2名。