载siRNA/SPIO纳米微粒靶向阻断及示踪TAM经MMP-1/PAR-1环路促胰腺癌神经转移的研究

Perineural invasion (PNI) in pancreatic cancer is a common pathologic phenomenon even in the early stages and PNI is correlates with poor prognosis of pancreatic cancer patients. However, the mechanism of PNI is unclear yet. Our previous studies shown that the tumor associated macrophages (TAMs) up-regulated MMP-1 levels apparently in pancreatic cancer cells, and enhanced the perineural invasion. Previous studies shown that protease-activated receptor 1 (PAR-1) is expressed in mouse dorsal root ganglia (DRG), which could be activated by MMP-1. And pancreatic cancer cells expressed the receptor of neurotransmitter substance P (SP), NK-1R. The above evidence indicated that there would be a cytokine loop mediated by MMP-1/PAR-1 between pancreatic cells and DRG, which induced the occurrence of PNI. In order to explore the molecular mechanisms underlying that TAMs promoted PNI of pancreatic cells via up-regulating MMP-1, in this project we intends to carry out the following researches: ① Experiments to verify the MMP-1/PAR-1/SP/NK-1R loop between pancreatic cancer cells and DRG. ② Chitosan nerve conduits containing nerves, cancer cells and TAMs would be used to mimic tumor microenvironment, and MR imaging would be used to tracer early PNI in rats. ③ To verify the potential therapeutic target inhibiting pancreatic cancer PNI, a nano vector would be used to deliver siRNA silencing MMP-1 targeted pancreatic cancer cells in mice. Our studies would provide a new idea for pancreatic cancer treatments.

胰腺癌发病早期易发生神经浸润（PNI）转移，预后极差，而PNI发生机制仍未明确。我们前期研究发现肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可致胰腺癌细胞分泌高水平基质金属蛋白酶1（MMP-1），并促进其沿神经转移。据报道小鼠背根神经节表达MMP-1受体PAR-1，胰腺癌细胞表达神经肽P物质（SP）受体NK-1R，提示胰腺癌细胞与背根神经节间可能存在MMP-1/PAR-1环路，诱导癌细胞沿神经转移。为明确TAMs上调胰腺癌细胞MMP-1促进其神经转移机制，本项目拟开展①验证MMP-1/PAR-1/SP/NK-1R环路；②构建壳聚糖神经导管环套鼠坐骨神经，填充胰腺癌细胞和TAMs模拟肿瘤微环境，MRI动态示踪PNI，体内模型验证MMP-1促进胰腺癌PNI；③利用课题组已制备免疫纳米载体荷瘤鼠体内靶向输送siRNA，沉默MMP-1基因，验证MMP-1/PAR-1作为新靶点以抑制PNI，为胰腺癌诊治提供新思路。

研究背景.胰腺癌发病早期易发生神经浸润（PNI）转移，预后极差，而PNI发生机制仍未明确。另外，由于缺乏早期检测体内神经转移的方法限制了这方面的研究发展。本项旨在达到以下目的：确定在胰腺癌细胞与神经元细胞之间存在MMP1/PAR-1/SP/NK-1R因子环路，并建立一种非侵入性方法来动态监测体内PNI。.主要研究内容：.1) 观察TAMs促进胰腺癌细胞PNI，验证胰腺癌细胞与DRG之间存在MMP-1/PAR-1/SP/NK-1R环路。.2) 目前常用于研究PNI动物体内模型不足之处是不能动态示踪肿瘤细胞PNI。本部分通过改良传统的坐骨神经转移动物模型，研究利纳米影像对比剂及MRI扫描动态观察胰腺癌鼠模型体内胰腺癌细胞PNI。.3) 本部分研究通过shRNA稳定敲低MMP、腹腔注射PAR-1抑制剂、或NK-1R抑制剂，观察胰腺癌神经转移程度，证明抑制MMP-1/PAR-1/SP/NK-1R环路可作为潜在靶点以抑制胰腺癌PNI。.重要结果及关键数据:.1) TAM与胰腺癌细胞株共培养后MMP1显著升高，癌细胞转移、侵袭及PNI能力显著增强。.2) MMP-1/PAR-1引起DRG的AKT通路磷酸化达到促进SP释放作用。.3) SP/NK-1R通过引起ERK磷酸化上调EMT转录因子TWIST，促进胰腺癌EMT及转移。.4) 构建裸鼠坐骨神经浸润模型，验证MMP-1/PAR-1/SP/NK-1R体内促胰腺癌细胞神经转移的作用。证明该环路可作为潜在靶点以抑制胰腺癌PNI。.5) 纳米影像对比剂标记癌细胞，MR扫描动态示踪PNI。我们的结果提示，MRI在第10天检测到PNI，常规方法在第20天才有阳性发生。在所有检测时间点，MRI影像表现与病理学结果均一致。我们结果也提示神经浸润的发生远早于神经功能损伤或可检测到的肿瘤生长。.科学意义：.肿瘤细胞沿神经转移是一种独立于血液和淋巴转移的特殊转移方式，但其发生机制仍不明确；另外，目前常用的神经转移体内模型均不能实现早期、动态观察癌细胞体内沿神经转移过程。本研究在细胞实验及裸鼠体内证明MMP1/PAR1/SP/NK1R环路促进胰腺癌神经转移。既往研究MMP促肿瘤转移作用主要关注其对微环境中基质蛋白的降解，本研究首次报道了MMP1/PAR1促进神经元释放神经递质SP，从新的视角证明MMP1通过诱导神经递质释放在胰腺癌神经转移中的促进作用