鸡前脂肪细胞的永生化研究

鸡的永生化前脂肪细胞系至今尚未建立，导致鸡脂肪细胞分化研究滞后，严重制约了鸡脂肪性状的分子机制研究。本研究拟采用逆转录病毒转染技术，首先,将鸡端粒酶逆转录酶基因（chTERT）和端粒酶RNA基因（chTR）分别或同时导入鸡前脂肪细胞，分析细胞端粒酶活性变化，确定鸡前脂肪细胞端粒酶活性的限速成分。然后,采用端粒酶活性重建和端粒酶活性重建与病毒癌基因导入合并应用两种策略，开展鸡永生化前脂肪细胞的筛选、鉴定及其分化特性的分析。本研究将为鸡脂肪细胞分化及其相关基因的功能研究提供理想的细胞模型，同时，也将为阐明鸡脂肪组织生长发育的分子遗传机理研究奠定坚实的基础。

本课题完成了预计的研究内容，达到了预定的研究目标。按照课题计划，我们克隆了鸡端粒酶逆转录酶基因（chTERT）的全长编码区和鸡端粒酶RNA基因（chTR）；构建了chTERT、chTR、E6及E7基因的逆转录病毒表达载体；转染包装细胞GP2-293，制备了各自相应的逆转录病毒。将chTERT和chTR逆转录病毒分别单独或合并感染原代鸡前脂肪细胞，利用新霉素（G418）或G418与嘌呤霉素（puromycin）联合使用筛选抗性细胞，最后检测抗性细胞的端粒酶活性。结果发现，chTERT可重建鸡前脂肪细胞的端粒酶活性，但chTR不能，由此断定，chTERT是鸡前脂肪细胞端粒酶活性的限速成分。研究还发现，在细胞导入chTERT基因的基础上，再导入chTR基因可进一步提高细胞端粒酶活性。连续传代培养和抗生素筛选，最终获得了两个永生化的细胞系ICPA-1和ICPA-2。ICPA-1和ICPA-2细胞系具有很强的增殖能力，目前ICPA-1细胞系已连续培养传代一年多（近500天），细胞群体倍增数（population doubling，PD）已达56；ICPA-2细胞系已培养273天，PD已达42，ICPA-1和ICPA-2细胞系仍具有很强的增殖能力。而作为对照的两批原代鸡前脂肪细胞CPA-1和CPA-2分别已连续培养了390天和270天，两批原代前脂肪细胞传代至PD8-9时，细胞即进入生长停滞期，此时细胞虽活着但已不再增殖。衰老检测（β-半乳糖苷酶染色）显示，ICPA-1和ICPA-2细胞系未见衰老细胞，而CPA-1和CPA-2培养至PD8-9时即可见大量衰老细胞。细胞端粒酶基因表达检测和端粒酶活性检测的结果表明，我们成功重建了细胞端粒酶活性。细胞形态观察、油红染色分析以及脂肪细胞分化标志基因的表达分析都提示，ICPA-1和ICPA-2细胞系仍保持原代鸡前脂肪细胞的形态特征和分化特性。根据这些实验结果可以断定，本课题已成功建立了永生化的鸡前脂肪细胞系。截至目前，尚无鸡前脂肪细胞永生化细胞系建立的报道。本课题首次建立了永生化鸡前脂肪细胞系，这也是第一个利用鸡chTERT和chTR基因建立起的鸡永生化细胞系。ICPA-1和ICPA-2细胞系有望作为鸡脂肪细胞增殖、分化、凋亡以及鸡脂类代谢调控等研究的体外细胞研究模型。