基于FRET的荧光探针的制备及活细胞内靶标蛋白浓度和活性的成像分析

Overexpression of some protein, such as thrombin and aurora kinase A, are a major hallmark of cancers. They are found to be related with a number of pathophysiological processes. Assessing its concentration and activation in living cells is mandatory for early diagnosis of cancer and next-generation drug design. Therefore the detection technology with the performance of high sensitivity and high selectivity for protein in living cells have to be explored. The system we describe here is based on a conformation switching stem-loop DNA scaffold which including nucleic-acid recognition element on each of its two stem strands, and nanoparticles SiO2@AuNPs. The binding of one target protein opens the stem, enhancing the emission of an attached fluorophore/quencher pair. The nanoparticles SiO2@AuNPs should improve the biocompatibility and stability of the biosensor in living cells. The sensors should respond rapidly and selectively, enabling the facile detection of specific proteins even in complex biosamples. This work will promote the detection of protein in living cells and the application for early diagnosis.

许多细胞内蛋白酶，如凝血酶、极光激酶等参与细胞内许多重要的生理过程，与癌症的发生和发展过程密切相关。但是这些肿瘤相关蛋白酶在早期患者细胞或体液中的浓度或活性极低，在细胞内各种活性小分子的作用下容易发生协同作用，因此要实现活细胞内蛋白酶的浓度和活性的准确检测，必须发展高选择性、高灵敏度、准确快速的分析方法。本研究拟设计包含DNA茎环、蛋白酶适体链和荧光能量共振转移基团的仿生纳米蛋白识别荧光探针，当探针与体系中靶标蛋白结合，则茎环被打开，释放荧光。当靶标蛋白被激活，其构象发生变化则脱离探针回到游离状态。我们将探针修饰在SiO2@AuNPs上，SiO2@AuNPs纳米粒子能帮助探针更容易得进入细胞，并保证探针在细胞内良好的稳定性和生物相容性。这一工作将为实现肿瘤细胞中靶标蛋白的原位检测做出一定的贡献。

本项目围绕生物样品中DNA和重金属的检测以及水环境的检测和保护做了如下工作：(1)通过静电纺丝技术制备了同轴纳米纺丝Pt/ITO，并以此为基底进行了动态核酸自组装，得到三维仿生纤维，并结合锁核酸信标制备了一种新型同轴生物传感放大器。该传感器具有良好的生物相容性、空间效应、同轴生物传感性能和单碱基识别能力。可用于检测癌细胞和患者血液中突变ctDNA; (2)提出了一种从天然物质中提取硫、氮制备共掺杂光致发光碳点的合成方法。该碳点的荧光能被Ag+显著猝灭，而且该碳点对环境和细胞友好。该方案不仅能实现对天然水体中Ag+浓度的高灵敏度检测，还能对活细胞内Ag+进行荧光成像检测和半定量分析; (3) 采用水热法和连续离子层吸附反应法在碳纤维表面生长Ag2S量子点修饰的TiO2纳米片。该三元异质结构界面能形成肖特基势垒和增加内电场，从而促进电子从杂化半导体到耦合金属的离解和迁移，表现出优异的光电化学性能和对金属出色的保护性能; (4) 我们研究发现三种可生物降解载体（稻壳、柚子皮和榴莲皮）组成的不同固相反硝化系统均在不同好氧水平（DO=2.5-7.5 mg/L）达到了高效的同步硝化反硝化性能，且富集到丰富的好氧反硝化菌，能为富铵水和废水脱氮提供技术支撑。