基于连接等温扩增技术检测mRNA剪接变体的研究

Messenger RNA (mRNA) splicing produces multiple mRNA splice variants, which is an important regulated mechanism of gene expression in the eukaryotes. Abnormal splicing is closely related to the occurrence of many diseases. Therefore, accurate quantitative methods of mRNA splice variants have important significance for cancer diagnosis research. So far, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) has been most popular method for mRNA splice variants assay. However, the primer extension reaction based on polymerase and the reverse transcription process from RT-PCR limited the specificity and sensitivity of mRNA splice variants assay. In this project, we put forward the innovative design of the two stem-loop structure of DNA probes at the exon-exon junction sites of mRNA splice variants. Probes can be directly ligated using post splicing mRNA as template, and which can implement high specificity analysis of mRNA splicing variants. Combining with efficient loop-mediated isothermal amplification techniques can achieve high sensitivity detection of mRNA splice variants. Moreover, we will encode the probes with different lengths for different mRNA splice variants to realize high-throughput analysis of mRNA splice variants using electrophoresis separation technique. This project will provide a powerful analytic method for highly specificity and sensitive detection of mRNA splice variants, which is of vital significance for molecular biology research and diagnosis research of major disease.

信使RNA（mRNA）剪接产生多种剪接变体，是真核生物调控基因表达的重要机制。异常的剪接与多种疾病的发生密切相关，对肿瘤特异性mRNA剪接变体进行准确定量分析对癌症诊断研究具有重要意义。目前，反转录聚合酶链式反应是最常用的分析mRNA剪接变体的方法。但是该方法的反转录过程和基于聚合酶的引物延伸反应限制了mRNA剪接变体分析的灵敏度和特异性。基于此，本项目创新性地提出在mRNA剪接变体的剪接位点设计两个茎环结构DNA探针，探针直接以剪接后的mRNA为模板在连接酶催化作用下进行连接反应，实现mRNA剪接变体的高特异性分析；结合高效的环介导等温放大技术，实现mRNA剪接变体的高灵敏度检测。另一方面，对探针长度进行编码，利用电泳分离技术实现mRNA剪接变体的高通量分析。本项目研究将为mRNA剪接变体的高特异性、高灵敏度检测提供强有力的分析工具，对分子生物学研究及重大疾病诊断研究具有重要意。

按照申请书所提出的研究任务，本项目围绕信使RNA（mRNA）剪接变体的检测开展了系统深入的研究，结合基于连接反应的环介导等温核酸扩增技术（LAMP），研究解决了高特异性、高灵敏度识别同一基因产生的多种mRNA剪接变体这一关键问题。本项目按计划完成了任务，针对mRNA剪接变体的特殊位点-剪接位点，分别设计两条特异性的茎环结构DNA探针，特异性的DNA探针能够在待测剪接变体的剪接位点邻近杂交，并被连接酶识别进行连接反应，而来源于同一基因的其他mRNA剪接变体虽然也能杂交，但是距离较远，探针不能被连接酶识别进行连接反应。连接反应产物具有双茎环结构，能够引发LAMP扩增反应。进一步以一个癌症基因的剪接变体为研究对象，针对每种剪接变体的剪接位点分别设计探针，每种mRNA剪接变体的探针的茎环部分为相同的碱基序列。因此，扩增不同mRNA剪接变体的连接产物过程中只需加入两个通用的引物，消除了由于引物序列不同产生扩增差异。连接反应实现了mRNA剪接变体的高特异性检测，LAMP扩增反应保证了mRNA剪接变体的分析检测的高灵敏度。可以检测低至100 aM的mRNA剪接变体，能够在样品中有效识别同一基因产生的剪接变体，所研究建立的分析方法灵敏度和选择性能满足临床分析检测实际样品的要求；并将所建立的研究方法应用于实际样品中mRNA剪接变体分析，取得了满意的结果。随后，我们将所构建的研究方法成功应用于融合基因的分析检测；基于以上的研究，本项目拓展到了microRNA、端粒酶等癌症标志物的高灵敏度、高选择性分析研究，取得了创新性的研究成果。