层粘连蛋白融合靶向神经营养因子组织工程化支架制备及其修复喉返神经损伤的机制研究

Neurotrophic factors could improve nerve regeneration. Although our previous studies have demonstrated that common application of LBD-BDNF and LBD-GDNF could improve nerve regeneration obviously, the effect was not particularly satisfying. We build a novel laminin fusion targeting neurotrophic factor tissue-engineered scaffold to find a better method. MicroRNA plays an important role in the survival, proliferation and differentiation of nerve cell. Our previous studies have demonstrated that miR-222 was up-regulated in using LBD-BDNF after recurrent laryngeal nerve injury, but the role and mechanism on peripheral nerve repairment still remains unknown. We predict PTEN may be a potential target gene of miR-222, and promote nerve regeneration by PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. In this paper, we used miR-222 lentivirus transfection both in vivo and in vitro after using compound biological scaffold to study its role in laryngeal nerve injury repairment. The important role of miR-22 in nerve cell regeneration will be tested through the above pathway. The study will clarify the mechanism that how miR-222 promotes the recurrent laryngeal nerve repairment, and may offer a new target of laryngeal nerve injury gene therapy.

神经营养因子可以促进喉返神经再生修复。课题组前期研究发现，联合应用LBD-BDNF和LBD-GDNF虽然可以明显促进喉返神经的再生，但效果并不令人特别满意，为寻求一种更为有效的修复方式，本课题构建了一种新型层粘连蛋白融合靶向神经营养因子组织工程化支架。微小RNA转录后对神经细胞存活、增殖及分化有重要作用。课题组前期研究表明miR-222在喉返神经损伤应用LBD-BDNF后表达上调，但它在神经损伤修复中的作用及其机制尚不明确。我们预测miR-222的靶基因可能为PTEN，通过PI3K/Akt/mTOR促进周围神经损伤修复。为验证以上假说，本课题通过体内、体外miR-222慢病毒转染实验，体外利用灌注型生物反应器构建组织工程化支架，评价该体系对神经再生的作用，验证miR-222在神经损伤修复中的重要作用，深度揭示miR-222促进喉返神经修复的机制，为喉返神经损伤基因治疗提供新的靶点。

针对喉返神经损伤，临床上往往无法取得满意的修复效果，此外，喉返神经轴突损伤后再生的分子机制也不十分清楚。本研究中，在体外利用灌注型生物反应器构建组织工程化支架，验证miR-222和miR-22-3p在神经损伤修复中的重要作用，明确了其促进喉返神经修复的机制，同时我们评估了脂肪间充质干细胞（ADSCs）小细胞外囊泡（sEVs）对体外雪旺细胞（SCs）增殖迁移的影响和联合生物可降解导管在体内对喉返神经再生的作用。从大鼠脂肪组织中分离出原代ADSCs，经表面抗原分析和体外多能诱导分化鉴定，收集细胞上清分离sEVs，通过透射电镜、NTA和Western Blot进行表征分析。通过分别与SCs和背根神经节（DRG）共培养，评价sEVs对外周神经再生的影响。通过对ADSCs和SCs的sEVs miRNA测序和SCs转录本测序，进行生物信息学分析及RT-qPCR验证，发现miR-22-3p具有较高的表达丰度及表达差异，通过过表达miR-22-3p发现其是通过转录后调控的方式直接抑制PTEN的表达，进而影响PI3K/AKT/mTOR通路，并且可以促进SCs的增殖和迁移。制备大鼠喉返神经截断伤模型，使用Zein神经导管联合sEVS修复大鼠喉返神经缺损，利用免疫组化、透射电镜分析其对喉返神经功能恢复的影响。体内实验表明，Zein神经导管与sEVs联合可以增加神经纤维的数量和直径，促进髓鞘的形成，肌肉功能、神经传导功能有恢复。综上所述，ADSCs来源的sEVs联合可降解神经导管是一种有用的、值得进一步研究的喉返神经损伤修复方法