猪DIRAS3基因调控胚胎附植中子宫内膜上皮-间质转化的分子机理研究

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) invovled in the implantation by altering uterine receptivity, but the molecular mechanism remains elusive. Present studies established the temporal and spatial pattern of endometrial DIRAS3 expression during the peri-implantation and post-implantation stage to determine the association of DIRAS3 expression with endometrial cell morphology in pregnant gilts. To determine whether DIRAS3 is involved in EMT and found signaling pathways proposed to EMT, lentiviral-mediated transfer of DIRAS3 to primary porcine endometrial epithelial cells. Our analyses would focus on the view of the cell morphology and the mRNA and protein expression levels of gene marker specific for epithelial cells and mesenchymal cells. To verify the impact of DIRAS3 gene mediated EMT in embryo implantation, intraperitoneal (i.p.) injections with anti-DIRAS3 antibody D1 = day of vaginal plug detection) and D4 to examine the ultrastructure of the potential implantation site in female mice compared to that of wild type animals. We also compared expression of mRNA and proteins of gene marker specific for epithelial cells and mesenchymal cells. Our study would clarify the molecular mechanism of EMT mediated by DIRAS3 during the implantation and the role of DIRAS3 expression in endometriun receptivity. The research could contribute to better understanding of molecular mechanism of endometriun receptivity and provide a novel inight on the resarch about the molecular mechanism of endometrial receptivity.

上皮-间质转化能改变猪子宫内膜容受性进而影响胚胎附植，申请人前期研究结果表明肿瘤抑制基因DIRAS3在胚胎附植不同时期差异表达，可能是调控上皮-间质转化重要基因之一，但有关其功能和具体作用机制在猪中尚未见报道。本研究拟以猪DIRAS3为研究素材，在检测附植前后子宫内膜组织形态变化及DIRAS3表达和定位变化基础上，通过慢病毒转染介导DIRAS3基因在猪子宫内膜上皮细胞中过表达和抑制表达并检测相关信号蛋白表达，从而揭示DIRAS3基因表达量对上皮-间质转化的影响及激活的信号通路。同时，通过在附植前小鼠子宫角中注射DIRAS3抗体，研究阻断内源DIRAS3蛋白的表达对上皮细胞表型和附植的影响，从而阐明DIRAS3基因对上皮-间质转化的调控机理及其在附植中的作用。本研究将有助于对子宫内膜容受性获得的调控机理认识，并为产仔数性状的遗传改良研究提供新的基因素材，也将为探讨附植的调控研究开辟新的视角。

上皮-间质转化能改变猪子宫内膜容受性进而影响胚胎附植。肿瘤抑制基因 DIRAS3在胚胎附植不同时期差异表达，且可能是调控上皮-间质转化重要基因之一，本研究拟以妊娠不同时期的梅山和大白母猪为研究素材，按项目要求完成相关研究，获得结果如下：(1) DIRAS3基因在梅山和大白猪附植前子宫内膜中的表达量显著高于附植完成后和妊娠中期(P < 0.05)。(2) DIRAS3基因在大白猪附植前子宫内膜腔上皮细胞中特异表达，在妊娠95天子宫内膜腺上皮细胞中特异表达。而在梅山猪妊娠26天，50天和90天均未检测到阳性信号。(3) DIRAS3过表达引起E-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达量上调。另外，DIRAS3基因过表达可上调Akt基因mRNA的表达量（P<0.05），而对Akt基因蛋白表达无显著影响。 (4) DIRAS3抗体注射后胚胎附植数目相对于对照组有所降低，且抗体注射组细胞间隙有所增加。(5) DIRAS3抗体注射后上皮细胞标记基因E-cadherin表达量上调，而间质细胞标记基因Vimentin表达量下调，说明拮抗DIRAS3基因的表达与上皮-间质转化有关，DIRAS3基因的表达可能抑制上皮间质转化的发生。通过本项目相关研究，进一步证明了DIRAS3基因在猪胚胎附植过程中的起着重要作用，并为产仔数性状的遗传改良研究提供新的基因素材，也将为探讨附植的调控研究开辟新的视角。