青钱柳细胞悬浮培养生产降糖活性三萜的诱导调控及其机制研究

Cyclocarya paliurus is an unique valuable plant growing in china with health care function, and now there is little resource available. Regulation of the production of hypoglycemic triterpenoids in the suspended cultured Cyclocarya paliurus cells under inducement and its mechanism will be studied by plant cell culture and secondary metabolic regulation technology. Triterpenoids will be separated and identified sequentially based on our earlier research on triterpenoids of suspended cultured Cyclocarya paliurus cells. HPLC fingerprint of triterpenoids in suspended cultured cells will be established. The mechanism of signal formation and transduction will be investigated based on the analysis of activity change of enzymes relating to signals, the action of MAPK pathway, the action of NO, H2O2, SA, and JA, and the cross talk among the forementioned 4 signal compounds. The regulation mechanism of yield and hypoglycemic activity of triterpenoids will be discussed based on the comprehensive analysis of changes in triterpenoid yield, in vitro hypoglycemic activity, fingerprint, and activity of key enzymes of triterpenoid synthesis. This research will provide theoretical references for the production of bioactive natural products by plant cell culture, and provide ideas and methods for further study of functional components of Cyclocarya paliurus, and also for further development and utilization of Cyclocarya paliurus resource. Therefore, this research is highly valuable both for academic study and application.

青钱柳为我国特有的高价值保健食品资源，本项目针对该资源匮乏现状，拟利用植物细胞培养和次生代谢调控技术,研究青钱柳细胞悬浮培养生产具有降糖活性的三萜化合物的诱导调控及其作用机制。项目在前期研究悬浮细胞三萜化合物分离鉴定和活性的基础上，继续分离鉴定其中的三萜化合物，建立基于HPLC方法的悬浮细胞三萜化合物指纹图谱；通过研究信号产生和传导相关酶活性的变化、MAPK途径在诱导调控中的作用以及NO、过氧化氢、水杨酸和茉莉酸的作用和相互关系探索诱导信号产生和传导的机制；通过综合研究诱导作用下三萜化合物产量、体外降糖活性和指纹图谱的变化，结合三萜合成关键酶活性的变化，探索利用诱导技术来调控三萜产量和降糖活性的作用机制。本项目可为植物细胞培养生产活性天然产物及其调控提供理论依据，为青钱柳相关功能因子开发及青钱柳资源的深度开发和利用提供思路和方法，具有重要的学术价值和很好的应用前景。

青钱柳是我国特有的珍稀、濒危植物，研究表明其叶含三萜、黄酮和多糖等多种活性成分，具有降糖、调脂、抗氧化等功能活性。三萜化合物是其中重要的一类活性物质，因具有降糖、抗炎等作用而备受关注。虽然青钱柳叶已经被批准为新食品原料，具有很高的开发利用价值，但其繁育非常困难，目前尚无大量人工繁殖和栽培的成功经验，资源稀缺局面短期内很难有根本性的改观。植物细胞培养生产天然产物具有周期短、可控性强、受自然条件影响小、操作简便等诸多优点，有望解决青钱柳资源匮乏制约其活性成分开发利用的难题。本项目对青钱柳细胞悬浮培养生产降糖活性三萜的诱导调控及其机制进行了研究。项目组建立了信息量丰富的青钱柳悬浮培养细胞三萜化合物指纹图谱；建立并优化了黑曲霉诱导子、硝普钠、过氧化氢、水杨酸和茉莉酸甲酯诱导细胞合成三萜的工艺技术，发现这五种诱导子中黑曲霉诱导子作用下细胞三萜的含量和体外降糖活性最高，活性提高的主要原因是三萜含量的增加和组成的变化；揭示了黑曲霉诱导子作用下一氧化氮、过氧化氢、茉莉酸和水杨酸四种信号分子在诱导信号传导网络中的位置、作用和相互关系，以及MAPK途径的作用和胞内SOD、POD、CAT、PLC和PAL五种氧化应激相关酶的变化规律；对黑曲霉诱导子作用下的细胞进行了转录组测序，获得了88144个转录本和67230个Unigene，并对Unigene进行了系统、全面的功能注释，同时对转录因子、茉莉酸和三萜合成途径基因的差异表达情况进行了详细的分析；诠释了“诱导信号产生→信号传导→基因表达变化→三萜合成量和组成变化→活性变化”的机制。本项目为植物细胞培养生产活性天然产物及其调控提供了理论依据，为青钱柳活性成分的开发和资源的深度利用提供了思路和方法。在本项目的资助下，发表了学术论文8篇，其中SCI和EI收录论文分别为3篇和2篇；培养了硕士研究生5人，其中4人已经毕业并获硕士学位。