氮素调控青钱柳三萜类化合物合成的机制研究

Terpenoids are natural physiological active ingredients of Cyclocarya paliurus. The synthesis and accumulation of terpenoids can be decreased by heavy nitrogen fertilization in cultivation systems, and therefore influenced the utilization value, while the regulation mechanism of this phenomenon is not clear. On the basis of our previous studies, the present study will inhibit the activity of glutaminase, the key enzyme of nitrogen assimilation, through methionine sulfoxide imide (MSO), for decreasing the carbon flow in nitrogen metabolism. 13C and 15N metabolic marker technique will be used to analysis the dynamic distribution of photosynthetic carbon between nitrogen assimilation and terpenoids biosynthesis pathways. Furthermore, the differentially expressed genes or differentially metabolic pathways will be filtered using high-throughput transcriptome sequencing technologies (RNA-Seq). Based on the RNA-Seq analysis, the key candidate genes of triterpenoid biosynthetic pathway will be screened. We would like to reveal the relationship between nitrogen assimilation and terpenoids biosynthesis from the overall, metabolic and genetic levels. This study aim at illuminate the metabolic mechanism of nitrogen control photosynthetic carbon allocated to terpenoids biosynthesis. The results can provide the basis for the high-yield cultivation and new variaties breeding of Cyclocarya paliurus and other medicinal plants.

萜类化合物是青钱柳中的重要活性成分，前期研究发现栽培中施N可抑制其生物合成，进而影响药用价值，但目前未见有关机制报道。本项目在前期研究工作的基础上，拟采用蛋氨酸亚砜亚胺（MSO）抑制青钱柳N素同化的关键酶谷氨酰胺酶（GS）的酶活性，以限制光合C向氮代谢途径的流动；利用13C和15N代谢标记技术观察光合C在萜类合成途径中的动态分配情况，并利用RNA-Seq技术筛选差异表达基因，并对青钱柳萜类合成关键候选基因进行表达分析，从整体、代谢和分子层次分析N素同化与萜类合成间的耦合关系，揭示N素调控青钱柳萜类合成的代谢机制。有关研究结果将对青钱柳及相关药用植物的高效栽培和良种培育具有重要理论意义。

青钱柳是我国特有的木本药用植物，具有增强人体免疫、抗“三高”等功效，三萜类是其叶中主要的活性成分之一。由于其自然资源稀少，目前主要以发展人工林为主。然而，人工栽培中，化学肥料的施用（尤其是N肥）虽然提高了叶片的收获量，但同时也强烈抑制了叶中三萜类的合成和积累，进而影响其药用价值，但目前未见相关机制的报道。本项目在前期研究工作的基础上，采用蛋氨酸亚砜亚胺（MSO）抑制青钱柳愈伤组织中N素同化关键酶谷氨酰胺酶（GS）的酶活性，以限制C代谢流向氮代谢途径的流动；同时利用13C和15N代谢标记技术观察光合C在萜类合成途径中的动态分配情况，并利用RNA-Seq技术筛选差异表达基因，并对青钱柳萜类合成关键候选基因进行表达分析，从整体、代谢和分子层次分析N素同化与萜类合成间的耦合关系，揭示N素调控青钱柳萜类合成的代谢机制。结果表明，MSO成功降低了GS的酶活性，使青钱柳愈伤组织新同化的N素明显减少（组织中15N的丰度仅为对照组的52%），同时N素同化和代谢产物游离氨基酸和蛋白质的含量也明显下降，这说明MSO是青钱柳N素同化和N代谢强度下降，即对C骨架的消耗减少。同时，利用HPLC-MS技术从青钱柳中检测到8种不同的三萜类化合物，它们的含量都受MSO的作用而显著升高，转录组结果也表明青钱柳三萜类合成途径中有关基因的表达水平上升，这也表明青钱柳中N素代谢水平的下降使更多的C代谢流分配到萜类合成途径中。总之，通过控制植物体N代谢强度，由于C代谢流分配的变化，可以使萜类等初生代谢强度增加。有关研究结果将对青钱柳及相关药用植物的高效栽培和良种培育具有重要理论意义和实际应用价值。