源自CRMP-2的新型肽段CBD3改善AD转基因小鼠认知功能的作用及其机制的研究

AD is the most common type of dementia. Numerous of studies indicated that calcium overload is the key process of pathophysiology in Aβ and tau induced neuronal degeneration and synapses deficiency. Aβ caused calcium influx,even calcium overload through affecting the activity and sensitivity of NMDARs, VGCC and other calcium channels, induced tau hyperphosphorylation and the changes of synapse plasticity, leading to LTP reduction and LTD elevation, thus, caused cognitive dysfunction. Hence, a viewpoint was proposed that calcium is the key target as modifying AD process. In our previous experiments, we have demonstrated TAT-CBD3 could decrease calcium influx in CaV2.2/NMDARs/NCX triple pathways in vitro, inhibit calcium overload, protect neurons from death. Our project chooses APP/PS1/Tau triple transgenic AD mice as research objects. We construct rAAV/NT4-TAT-6His-CBD3 with molecular biotechniques to treat the AD transgenic mice by intranasal administration. Then we lucubrate the effect and mechanism of treatment by animal behavior test, biochemical test, electrophysiological techniques and calcium imaging, providing fundamental basis for TAT-CBD3 to be a novel therapeutic drug of the early stage of AD.

AD是痴呆最常见类型。诸多研究结果提示钙超载是Aβ和tau蛋白诱导神经元变性和突触缺失的重要病理生理过程，Aβ通过影响NMDARs、VGCC及其它离子通道的活性和敏感性，使钙离子进入细胞内，出现钙超载，诱导tau蛋白过度磷酸化并改变突触可塑性，降低LTP，升高LTD，从而导致认知功能下降，因此提出控制钙超载可以作为修饰AD病程的关键位点。我们前期的研究已经证实TAT-CBD3能够在体外通过CaV2.2/NMDARs/NCX三条途径减少钙离子内流，抑制钙超载，起到神经保护作用。本项目选取3×Tg AD转基因小鼠模型为研究对象，拟应用分子生物学技术，构建表达NT4-6His-TAT-CBD3的rAAV，通过滴鼻法对AD小鼠进行治疗，并通过一系列实验对TAT-CBD3改善认知功能的作用及其机制进行深入研究，为新型钙离子拮抗剂TAT-CBD3成为AD早期治疗药物提供理论依据。

背景：阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是痴呆最常见的类型，其发病机制及过程非常复杂，并且涉及到许多分子学、细胞学和生理学的病理机制。近年来的诸多研究结果提示钙超载是Aβ和tau蛋白诱导神经元变性和突触缺失中的重要病理生理过程，我们前期的研究结果显示TAT-CBD3短肽对神经元内的钙超载现象具有一定的缓解作用，但是TAT-CBD3半衰期较短，常规用药起不了作用，因此，本研究拟定构建TAT-CBD3重组腺病毒质粒，采用滴鼻给药方式治疗小鼠AD模型，探究TAT-CBD3腺病毒质粒治疗方式对AD小鼠中神经元内钙超载与Aβ级联假说，神经元凋亡等致病机制的缓解情况。方法：本研究采用 分子生物学方法，构建携带NT4-TAT-6His -CBD3和NT4-TAT基因（对照）重组腺病毒 (pAAV-CAG-MCS-EGFP-3FLAG AOV002)质粒，并采用滴鼻给药的方式处理APP/PS1二转基因AD模型小鼠，分别给与NT4-TAT-6His -CBD3重组病毒、NT4-TAT重组病毒（空载）、以及安慰剂（模型组），C57BL/6J小鼠作为正常空白对照，与第1天和第21天分别滴鼻（50 ml/只/次，病毒滴度1x1013/mL，右侧鼻腔）。第二次给药9天后行水迷宫检测小鼠认知情况，随后处死小鼠，分离海马区神经元进行全细胞电压膜片钳技术检测神经元钙超载现象，收集脑组织及脑补匀浆，组织病理学、免疫组织化学、以及western blot方法检测Aβ级联假说相关蛋白（Aβ1-42，t/p-Tau和ADAM10），Tunel方法检测神经元凋亡情况。结果：以NT4-TAT-6His -CBD3重组腺病毒滴鼻给药治疗APP/PS1二转基因AD模型小鼠后，与AD模型组小鼠相比，给药组小鼠认知功能障碍得到缓解；神经元钙超载现象得到缓解；Aβ1-42表达被显著抑制；磷酸化p-tau蛋白表达被显著抑制；神经元凋亡现象被抑制。但重组腺病毒对AD小鼠海马区ADAM10表达和以及t/p-Tau聚集和蛋白表达没有明显的抑制作用。空白组与模型组差别不明显。结论：本研究结果表明NT4-TAT-6His-CBD3重组腺病毒滴鼻给药治疗能够缓解神经元细胞内的钙超载现象，并对AD小鼠海马区神经元具有明显保护作用。