非小细胞肺癌EGFR-TKI类靶向药物新的耐药相关基因的作用和分子机制研究

With the application of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor ( EGFR-TKI ) targeted drugs in non-small cell lung cancer ( NSCLC ), a good effect was achieved, and problem about drug-resistant appears sequentially, however, the resistance mechanisms have not been fully elucidated, seriously affects the process of individualized targeted therapy. Meanwhile our patients have the own gene mutation characteristics. Therefore, this study intends to use EGFR-TKI resistant cell lines which we have constructed artificially, with the use of high-throughput technologies to screen out tyrosine kinase protein coding region of point mutations, receptor tyrosine high expression of the kinase and MAPK signaling pathway molecules which associated with NSCLC patients with EGFR-TKI resistance, then verify molecular markers and explore the mechanisms of acquired resistance in vitro cell lines. We hope to obtain the molecular biomarkers associated with EGFR-TKI resistance in NSCLC, get in-depth understanding of EGFR-TKI acquired resistance, by exploring the mechanism of new drug-related genes, in order to guide clinical practice, verify drug-benefit groups, provide new targets and improve the level of individualized treatment, with important clinical significance and application prospects.

表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)类靶向药物在具有EGFR基因突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者治疗中取得了较好的疗效，但耐药问题日渐突出，耐药机制目前尚未完全阐明，严重影响了个体化靶向治疗的进程。同时我国患者的基因突变存在自身的特点。我们拟针对本研究组已人工诱导构建的EGFR-TKI耐药的非小细胞肺癌细胞株，利用高通量研究技术，筛选出酪氨酸激酶蛋白编码区点突变、受体酪氨酸激酶和MAPK信号通路分子的高表达等新耐药相关基因变异位点，并在细胞水平进行验证，进一步探索其作用方式和功能。希望通过探索新发现的耐药相关基因的作用机制，更全面深入的认识EGFR-TKI获得性耐药，得到新的耐药相关分子标志，从而克服耐药和指导临床合理用药，开发新药和提升我国个体化诊疗水平，具有重要的临床意义和应用前景。

本课题应用EGFR-TKI类靶向药物吉非替尼持续低浓度作用于非小细胞肺癌细胞系H1650（吉非替尼敏感型）构建了耐药细胞系H1650GR（GR，gefitinib resistant），应用HumanOmniZhonghua-8 BeadChip（Illumina）对H1650GR和对照敏感细胞株H1650进行了exome-seq、RNA-seq和SNP芯片分析。Exome-seq结果显示，与H1650相比，H1650GR中有8个特有的错义突变，其中LAX1、EPHB6和TRPC6 3个基因的突变可能对其编码蛋白质结构有影响。RNA-seq结果显示，在H1650GR细胞中共检测到2306个表达变化的基因，其中1051个基因表达下降，1255个基因表达上调；MAPK和PI3K/AKT信号通路中分别有28个和41个差异表达的基因，此外，编码激酶的MAPK4、EIF2AK2、EPHB6和MYLK基因高表达。SNP结果显示，H1650GR细胞中拷贝数扩增区域有47个表达上调的基因，变化倍数最高的5个基因分别是 MUC13、LAMP3、HGD、MYLK 和HEG1；拷贝数缺失区域有61个表达下调的基因，变化倍数最高的5个基因分别是TCF4、SERPINB7、SERPINB3、SERPINB4和ALPK2。随后，我们应用实时定量PCR技术初步验证了筛选得到的差异表达基因的mRNA的相对表达量，结果显示在验证的40个基因中，ICK、MYLK、PTP4A1、MAP2K7、MAPK4在耐药细胞系H1650GR中高表达，ALPK2、TGFA、FZD4、KLF16、MAP2k2在耐药细胞系H1650GR中低表达。综合分析以上高通量筛选结果，受体型酪氨酸激酶 EPHB6在耐药细胞系H1650GR中既有mRNA水平的高表达也有点突变，且其突变可能使得该蛋白的激酶结构域恢复功能，故推测EPHB6可能为潜在的耐药分子标志。我们随后在细胞水平上对EPHB6基因突变的作用进行了探索和验证，结果表明，EPHB6基因突变通过增强AKT蛋白磷酸化，抑制细胞凋亡，进而导致耐药。同时，我们还收集了临床经EGFR-TKI药物治疗后耐药的穿刺组织或恶性胸腔积液标本，为将来进一步分析耐药相关因素在EGFR-TKI类药物耐药的NSCLC人群中的发生频率，以及评价其与药物疗效的关系提供支持和保障。