Plag1-Egr1-CD44通路在Plag1转基因小鼠唾液腺肿瘤干细胞成瘤中的作用

Human pleomorphic adenoma is a tumor of mixed benign and malignant features. Plag1 transgenic mice spontaneously develop salivary gland tumors that faithfully reproduce the pathological features of human pleomorphic adenoma, including its low malignant tendency. We have previously isolated highly tumorigenic tumor stem cells,characterized by CD44hi on cell surface and simultaneous expression of CD133 and CD117, in the aforementiond mouse model. We also found that Plag1 activates Egr1 gene transcription. Egr1 has been implicated in CD44 gene regulation in lymphocytes. Based on these findings, we speculate that Plag1 upregulates CD44 through Egr1, to exert its role in tumor stem cell development. In the current proposal, we plan to employ molecular biology and immunological tools, to study the role of Plag1 on Egr1 and CD44 gene transcription and protein expression, and to dissect key molecular events implicated in tumor stem cell development. We will then interrogate the functional significance of CD44 in tumor formation associated with tumor stem cells. Results from this proposal will shed light on the molecular pathogenesis of salivary gland tumor, and provide new therapeutic targets.

人多形性腺瘤介于良、恶性之间，而Plag1转基因成瘤小鼠成功模拟了人的多形性腺瘤同时具有低度恶性倾向。最新研究发现在该小鼠成瘤模型中可以分离到具有体内高成瘤能力的肿瘤干细胞，高表达CD44hi，且该群细胞更富集CD133和CD117。前期研究已经证实Plag1激活了Egr1基因，而Egr1通路可引起CD44上调。据此，我们推测Plag1通过激活Egr1上调CD44启动了肿瘤干细胞的信号通路。本课题拟利用分子生物学、免疫学通过基因水平、蛋白水平的检测和定位以及RNA干扰，证实CD44不仅是Plag1转基因小鼠肿瘤干细胞的标志物，而且发挥了生物学效应，即由Egr1启动下CD44参与的肿瘤干细胞信号通路。本课题将从新的视角来阐明涎腺肿瘤发生的信号通路，并为良性和恶性多形性腺瘤的防治提供新靶点。

项目背景：Plag1 转基因成瘤小鼠成功模拟了人的多形性腺瘤同时具有低度恶性倾向，但Plag1 致瘤机制仍待进一步研究。项目申请者本人在该小鼠唾液腺瘤模型中成功分离到具有高度体内成瘤能力的CD44hi 标记的肿瘤细胞，这些肿瘤干细胞可能导致了肿瘤的发生、生长甚至恶性倾向。研究内容：再次研究了plag1转基因成瘤小鼠肿瘤芯片，其中显示p53基因与Plag1基因的相互作用和多形性腺瘤的生长速度增快有关。因此建立p53基因敲除plag1转基因小鼠模型，揭示多形性腺瘤的可能出现的恶变机制。同时进行了Plag1-Egr1-CD44通路在Plag1转基因小鼠唾液肿瘤干细胞成瘤中的作用的相关研究，进行了CD44质粒及shRNA载体构建，重组慢病毒包装，和转基因小鼠颌下腺肿瘤细胞的分离和培养，及慢病毒感染及干扰后生物学行为变化及EGR1基因干预对转基因小鼠肿瘤细胞生物学行为影响。重要结果：构建的Plag1+p53-/-基因型小鼠生长迟缓，寿命短，未能长出肿瘤便已死去，而Plag1+p53+/-基因型小鼠的肿瘤生长速度较同龄Plag1+p 53+/+小鼠相比较快，且有明显差异。将Plag1小鼠肿瘤细胞按CD44分选成为CD44hi细胞和CD44neg细胞。慢病毒Lev-CD44, Lev-shRNA-CD44成功转染小鼠涎腺肿瘤干细胞，转染效率高。CD44hi转染Lev-shRNA-CD44后，促进其凋亡,抑制其侵袭；CD44neg转 染Lev-CD44后，抑制其凋亡，促进其侵袭。关键数据：建立p53基因敲除plag1转基因小鼠模型，显示p53基因与plag1基因的相互作用和多形性腺瘤的生长速度增快有关。CD44hi细胞和CD44neg细胞转染Lev-shRNA-CD44，Lev-CD44后表现的侵袭和凋亡和CD44的量有直接关系，各指标相关蛋白Bax,p53，MMP-9， p-ERK/ERK同样具有上述趋势。对于CD44hi，在加入pcDNA-Egr-1后，促进其凋亡，抑制其增殖，若加入抑制剂Cox2后，抑制其凋亡，促进其增殖侵袭。对于CD44neg，无论是加入pcDNA-Egr-1或者抑制剂Cox2， 对其凋亡、增殖及侵袭，无明显影响。科学意义：CD44hi可以作为肿瘤干细胞的一个标志物。