短波蓝光辐射下caspase-1/GSDMD通道介导的晶状体上皮细胞焦亡在白内障发生中的作用及其机制研究

Cataract is one of the major blindness eye disease in our country. But the mechanism of cataract has not been fully elucidated. It was thought that oxidative damage, apoptosis, autophagy, and etc. are the main causes of cataract. Studies have shown that pyroptosis is mediated by cysteine protease (caspase) - 1 and gasderminD (GSDMD) is the downstream targets of induced pyroptosis. Shortwave blue-light can make the programmed death of lens epithelial cells(LECs). In the preliminary experiments we found that with the increasing of illumination intensity of shortwave blue-light, GSDMD-N-terminal domain structure protein expressed higher level. We have reasons to assume that pyroptosis of lens epithelial is mediated by caspase-1/GSDMD channel under shortwave blue-light radiation. To test this hypothesis, we will study the change of lens transparency under different exposure time and intensity of the shortwave blue-light, and we will observe the influence of the shartwave blue-light on LECs. We also use confocal microscope ,flow cytometry instrument, immunohistochemistry technology, gene knockout technology, and molecular biology technology to study the LECs signaling pathways and LECs membrane channel on the site. In brief, this topic will be a new perspective to clarify pyroptosis in the mechanism of age-related cataract, which supplies the new targets for cataract controlling.

白内障是我国主要的致盲眼病之一，其发病机制尚未完全阐明，既往认为白内障的发生与氧化损伤、凋亡、自噬等有关。研究表明半胱氨酸蛋白酶（caspase）-1可以介导经典焦亡径路，gasderminD（GSDMD）是诱导细胞焦亡的下游靶标，短波蓝光能够引起晶状体上皮细胞的程序化死亡。在预实验中我们也发现随着短波蓝光照明强度的提高，GSDMD-N端结构域蛋白质表达上调。我们推测短波蓝光辐射下caspase-1/GSDMD通道介导了晶状体上皮细胞焦亡。为了证实这一假说，我们将观察不同照射时间和强度下短波蓝光对晶状体透明度的影响，采用共聚焦显微镜、流式细胞仪、免疫组化技术、基因敲除技术和分子生物学技术观察短波蓝光辐射下晶状体上皮细胞信号传导通路及晶状体上皮细胞膜上孔道的位点，本课题将从焦亡的角度阐明年龄相关性白内障的发病机制，为白内障的防治提供新的靶点。

白内障是我国主要的致盲眼病之一，手术是白内障的首要治疗手段，但是由于白内障手术技术水平参差不齐，白内障手术后的疗效差距较大。积极探索白内障的致病因素，减少白内障发病率具有十分重要的意义。我们针对短波蓝光辐射下晶状体上皮细胞产生焦亡及其信号通路进行了深入的研究。我们研究了短波蓝光辐射下晶状体透明度的变化、HLE-B3细胞中焦亡的发生、细胞焦亡时的形态学变化、以及caspase-1/GSDMD细胞下游焦亡通路的作用机制等，获得了一系列研究成果。. 动物实验中，短波蓝光辐射下晶状体的混浊具有蓝光照射的时间和亮度依赖性；我们使用qRT-PCR和Western blot检测了短波蓝光照射4、8和12周，在短波蓝色照射下caspase-1的相对表达水平明显高于对照组；同样短波蓝光照射组caspase-11和GSDMD表达水平也明显增高。以上数据表明：在短波蓝光辐射下晶状体出现了混浊，而且焦亡的相关指标出现了表达增高现象。. 在细胞水平的研究中，HLE-B3 hLECs除了对照组做无光培养，蓝光辐射组和caspase-1抑制组分别采用单位面积光照度2500lux，450nm的短波蓝光持续照射不同时间。各组HLE-B3细胞在照射结束后取出部分细胞冲洗固定后做显微镜下形态学观察：短波蓝光辐射下随着照射时间的延长，晶状体上皮细胞发生数目的减少，肿胀和严重变形，呈现了典型的焦亡形态学改变；流式细胞仪检测，短波蓝光辐射下晶状体上皮细胞双阳着染（焦亡）情况表明，随着照射时间的延长，细胞焦亡的比例越大，caspase-1抑制剂组虽然表现出同样的趋势，但是焦亡的比例低于蓝光辐射组；免疫荧光结果显示：随着短波蓝光照射时间的延长，caspase-1在细胞质中的表达水平逐渐升高，并定位于细胞质的非特异性位置。而GSDMD-N在细胞质中的表达逐渐增加，定位逐渐从细胞质转移到细胞膜上，但在细胞核中均未表达，认为短波蓝光辐射下晶状体上皮细胞膜上形成孔道；以qRT-PCR及Western Blot检测各组细胞中caspase-1，GSDMD-N/C的mRNA及蛋白的表达。 以上研究证实了caspase-1/GSDMD通道介导了短波蓝光辐射下晶状体上皮细胞焦亡的假设。对阐明年龄相关性白内障的发病机制有重要意义，为白内障的防治提供新的靶点。