高同型半胱氨酸血症FABP4 DNA甲基化作用及特异性miRNAs调控机制的研究

动脉粥样硬化(AS)是以脂代谢紊乱为主的慢性炎症性疾病, 高同型半胱氨酸血症(HHcy)是否通过炎症和脂代谢交叉靶基因FABP4 DNA甲基化异常引起AS未见报道,前期研究HHcy时发现同条件下不同基因的DNA高、低甲基化并存,提示存在深层次调控机制,因此本项目拟复制HHcy模型,实时PCR等检测AS斑块FABP4的变化,在单核/巨噬细胞中使其沉默和过表达验证FABP4的作用;高通量荧光法检测AS斑块中FABP4 DNA甲基化及DNMTs等调控因子变化,分别沉默和过表达DNMT1,阐明FABP4 DNA甲基化的作用机制,确定调控的关键靶点; 运用微阵列技术筛选HHcy特异性miRNAs表达,在单核/巨噬细胞中使其沉默和过表达后予以验证;构建携载DNMT1重组质粒,转染细胞,探讨特异性miRNAs调控DNA甲基化机制,本课题旨在阐明HHcy分子机制,为HHcy靶向治疗提供理论依据。

高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia, HHcy)是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)重要的独立危险因子之一。DNA甲基化作为表观遗传学的重要调控方式在Hcy致AS形成过程中发挥重要作用，可以影响整体基因组和单个基因启动子区的DNA甲基化变化进而影响基因表达水平，参与动脉粥样斑块形成。脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid binding protein 4，FABP4)已被证实与AS密切相关，但其作用机制是否受DNA甲基化调控尚不清楚。MicroRNA(miRNA)作为近些年研究比较热的小分子非编码RNA，是否也参与DNA甲基化调控仍未见报道。本研究选用健康5周龄雄鼠(SPF级C57BL/6J)和ApoE-/-鼠(SPF级近交系C57BL/6J)随机分为正常对照组、高脂血症组、HHcy组、干预组(n=12)。分别在整体和细胞水平检测FABP4表达改变，利用基因重组、慢病毒感染等分子生物学手段检测FABP4是否受甲基化调控及其可能机制如何，并筛选验证可能调控DNA甲基化改变的特异性miRNA。结果发现，HHcy可诱导ApoE-/-鼠主动脉FABP4高表达，加速巨噬细胞吞噬胆固醇酯形成泡沫细胞，促进AS的形成。且ApoE-/-鼠主动脉FABP4启动子区发生去甲基化改变，调控脂代谢和炎症反应交叉靶基因FABP4 mRNA和蛋白高表达，可能是HHcy促进AS形成的机制之一。叶酸和VB12的干预可拮抗部分Hcy的影响，缓解AS的形成。miR-148a/152是DNMT1的特异性miRNA，miR-148a/152可能通过直接与DNMT1 mRNA 3’UTR UGCACUG碱基特异性结合抑制DNMT1的转录过程进而影响其表达水平，进而引起FABP4表达增高促进泡沫细胞内总胆固醇和胆固醇酯含量参与了Hcy致泡沫细胞形成过程。. 该项目已发表论文26篇，其中SCI 7篇，中文核心14篇，省级期刊5篇，已完成科技成果鉴定并于2012年获宁夏回族自治区科技进步二等奖。培养硕士研究生研究生9名，均以毕业，其中2名获研究生国家奖学金，2名获宁夏回族自治区优秀硕士论文奖，2名博士在读。