PPO影响蝴蝶兰外植体褐变发生的机理研究

课题组前期研究结果证实，蝴蝶兰叶外植体褐变发生与PPO活性相关，在已经克隆蝴蝶兰PPO基因的基础上，了解PPO活性以及基因和蛋白表达发生变化的时间，用PPO酶活性抑制剂和蛋白合成抑制剂处理外植体，检测PPO活性以及基因和蛋白表达与对照的差异，明确PPO影响蝴蝶兰叶外植体褐变发生的时间。通过分析PPO mRNA在外植体组织的时空分布变化；以及经蛋白合成抑制剂处理后，PPO mRNA分布差异，进一步认识PPO mRNA分布时空差异与外植体褐变的关系。分析外植体组织细胞中PPO蛋白的时空分布变化，以及蛋白合成抑制剂处理后PPO蛋白分布变化，认识PPO分布与褐变发生的关系，同时了解新合成的PPO是否参与该过程。本研究对认识PPO在外植体褐变发生的作用，全面认识外植体褐变发生的分子机理提供基础。为今后控制重要观赏花卉和木本植物组培过程中褐变发生，建立高效的遗传转化再生体系提供技术依据。

研究PPO在蝴蝶兰外植体褐变发生初期的作用，发现培养6 h- 24 h 外植体PPO活性与培养0h没有显著差异，培养3d PPO活性显著高于培养0h外植体酶活。经PPO酶活性抑制剂柠檬酸和蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理后，培养24h-3 d PPO酶活性显著低于未处理的对照。总酚含量分析结果表明，总酚在培养6h外植体含量最高，高于培养0h、24h、3d的总酚含量，柠檬酸处理和CHX处理抑制了培养6 h外植体内总酚含量。Northern boltting分析表明，培养6h PPO基因表达显著增加，随培养时间延长，保持较高的表达量。放线菌酮处理和柠檬酸处理显著抑制了PPO基因表达，CHX处理仅在培养6 h 外植体可以检测到PPO基因表达。柠檬酸处理降低PPO表达，在培养3d的外植体基本检测不到PPO表达。从基因表达分析可见，PPO在培养6 h就开始启动影响蝴蝶兰外植体褐变发生。蛋白表达分析结果表明，PPO蛋白表达量随培养时间增加升高，24 h-3 d都维持在一个较高水平的表达量。CHX和柠檬酸处理抑制了PPO蛋白表达，CHX处理在培养6 h外植体内PPO蛋白低于未处理外植体，随后蛋白量持续降低。原位杂交实验结果也证实，培养6 h蝴蝶兰外植体PPO mRNA在胞质和维管束都有较高的表达量，培养24 h和3 d外植体胞质和维管束都检测到PPO mRNA表达，CHX处理对PPO mRNA在组织中的分布没有显著影响，但是表达量显著低于未处理的对照。酶免疫组化和胶体金分析也证实在褐变发生前期PPO分布没有变化，培养6 h外植体内维管束PPO酶蛋白含量较高，CHX处理未影响外植体PPO酶蛋白在组织中分布。分析PPO在细胞内的分布，发现主要分布于蝴蝶兰外植体细胞叶绿体中，培养6 h的外植体存在较多PPO的胶体金颗粒，培养3 d的胶体金颗粒最多。放线菌酮处理未影响PPO在细胞内的分布，叶绿体内PPO胶体金颗粒较少，表达量低。.Western blotting 的实验结果表明，培养0h的外植体PPO有较高表达量，说明PPO的生物合成在蝴蝶兰早期就已经完成，酶蛋白随培养时间增加含量增加活性增强，说明新合成的蛋白参与了随后褐变的发生过程。CHX处理降低了PPO酶蛋白的含量，从而抑制了外植体褐变发生。但因为外植体内已经存在PPO酶原，CHX处理只是降低了褐变发生情况，不能完全抑制褐变发生