水稻红莲型恢复基因Rf6育性恢复分子机理研究

Honglian-type is a new type in gametophytic cytoplasmic male sterility (CMS) rice, and the honglian restorer gene research with important scientific and applied significance for the gene information exchange as well as utilization of heterosis.Early, we had mapped the restored gene Rf6 in a region about 200Kb in chromosome 8, and constructed BC1F1and F2 population with plants containing only Rf6 single gene. Here,on this basis, the project will finished functional complementation validation using the agro bacterium-mediated transformation methods, and the RF6 protein will be expressed with prokaryotic system, the RF6 monoclonal antibodies will be prepared ;we will use EMSA technology to analysis the relationship between the RF6 and the sterility gene transcription Atp6-Orfh79 mRNA; the bacterial two-hybrid, yeast two-hybrid and tandem affinity purification labels will be used to screen the proteins interacting with RF6 and validation with the technology of SPR, CO-IP, pull-down and RNAi. Furthermore, we will also use the molecular marker-assisted selection technology to pyramiding restore gene for strong recovery lines breeding in the HL- type rice.

水稻红莲型是配子体细胞质雄性不育新类型，研究其败育和育性恢复对于核质互作、基因信息交流以及杂种优势利用都具有重要的科学与应用意义。前期，我们将红莲型水稻新恢复基因Rf6定位在第8染色体约200Kb的区域内，并用只含Rf6的单基因材料构建回交群体和F2群体进行精细定位。在此基础上，本项目用农杆菌介导法进行功能互补验证；进一步用原核表达系统表达和纯化RF6蛋白，制备RF6单克隆抗体，利用EMSA技术分析RF6与不育基因转录本Atp6-Orfh79mRNA相互作用关系，利用细菌双杂交、酵母双杂交和串联亲和纯化标签等方法筛选RF6蛋白互作因子，并利用SPR、CO-IP、pull-down和RNAi等技术进行验证，解析其中一些重要因子的生物学功能，从而揭示恢复基因的育性恢复机理；项目还将利用分子标记辅助选择技术聚合恢复基因，为红莲型水稻强恢复系选育奠定基础。

1972年，武汉大学研究团队利用海南红芒野生稻与江西地方品种莲塘早杂交并多代回交，1974年培育出红莲型水稻。红莲型水稻为配子体细胞质雄性不育类型，花粉为二核期圆败，具有高产优质，广适高效等优点，在我国长江流域，华南稻区，国外东南亚国家如：越南、印度尼西亚、孟加拉和巴基斯坦等大面积推广种植。我们前期研究发现，红莲型水稻的不育性可为Rf5和Rf6两对独立的恢复基因所恢复正常，Rf5与胞胎型水稻Rf1A为同一个基因，位于第10染色体，Rf6则不同，被定位于第8染色体端部，进一步克隆并研究其分子作用机理具有重要的理论与实践意义。为此，在前期精细分子定位Rf6的基础上，本项目通过功能互补实验证实了候选基因Orf2可恢复红莲型水稻不育系粤泰A（YTA）的不育性，由此成功克隆了Rf6。序列分析发现，Rf6与目前所有已克隆的恢复基因不同，是个新基因，其含20个PPR串联重复单元，其第3、4 、5三个PPR串联基序在其后发生了一次重复，从而具备恢复功能。在RF6的3、4 、5三个PPR串联基序中，凡第3号PPR基序发生重复的就能恢复不育性，而重复4或5不具有恢复能力，且PPR基序3后面若紧跟4，也具有恢复能力，但PPR基序3后面紧跟5，则不具有恢复作用。利用水稻悬浮细胞表达发现Rf6定位于线粒体，当Rf6存在时，红莲型水稻不育基因转录本Atp6-Orfh79mRNA被加工为两个小转录本，其加工的位点位于Orfh79转录本下游第10个碱基处。我们利用EMSA、酵母双杂交、Pull-down、Co-IP及RNAi等实验分析发现，RF6蛋白与不育基因转录本Atp6-Orfh79mRNA并不发生直接相互作用，而是与OsHXK6分子互作，形成蛋白分子复合体恢复不育性。同时，我们利用分子标记辅助选择技术，创制了红莲型水稻双恢复基因育种中间材料，为选育红莲型水稻强恢复系奠定了基础。以上这些研究成果对于植物配子体细胞质雄性不育性恢复研究具有重大的理论指导意义，而对于培育作物强恢复系则具有很强的实践指导意义。