水稻红莲型恢复基因Rf6的克隆、机理和应用研究

Cytoplasmic male sterility and fertility restoration system is the base of hybrid seeds production and also the ideal material for research genetic information exchange between the nucleus and organelles.Early, we found that the Rf5 and Rf6 genes can independent recovery sterility, and the Rf5 had been cloned and the Rf6 is located on chromosome 8. Here,the new restore fertility gene Rf6 will be cloned by a map-based clone strategy and to subcellular the RF6 protein by using the fluorescent labeling method. The RF6 protein and monoclonal antibody will be prepared to incubation with the Atp6-Orfh79 mRNA of which the HongLian male sterility transcription with the EMSA experiment, and found out the co-factors that interact with RF6 directly using the system of bacterial and yeast two-hybrid. The primer extension experiment will be used to obtain the splice sites of Atp6-Orfh79 mRNA transcription under the function of Rf6 gene. And last, we will get some new rice materials which the combinations of two restore genes Rf5 and Rf6 by the marker-assisted selection approach.

植物细胞质雄性不育与育性恢复系统是研究细胞核和细胞器间遗传信息交流的理想材料，也是利用杂种优势生产杂交种子的基础，具有重要的理论和实践意义。前期，我们发现红莲型水稻可为Rf5和Rf6两对核基因独立恢复不育性，其中Rf5已克被隆，Rf6被定位于第8染色体上，本项目在此基础上拟图位克隆出Rf6，用荧光标记技术亚细胞定位RF6，原核表达纯化RF6蛋白，并制备RF6单克隆抗体，用免疫共沉淀和凝胶阻滞等技术探明RF6与不育基因转录本Atp6-Orfh79 mRNA是否发生直接相互作用，引物延伸实验确定在恢复基因Rf6存在下不育基因转录本Atp6-Orfh79 mRNA的剪接位点，通过细菌双杂交和酵母双杂交等技术获得恢复基因RF6蛋白互作因子，并简析出其中一些因子的生物学功能，揭示育性恢复的分子机理；最后，通过杂交、回交和自交等常规技术与分子标记辅助选择技术相结合，创制聚合双恢复基因的红莲型水稻材料。

水稻是我国的重要粮食作物之一，杂交水稻为保障国家粮食安全做出了巨大贡献。红莲型是我国杂交水稻的重要遗传资源，深入研究其育性基因和分子基因具有重要的理论和实践意义。红莲型水稻育性恢复受Rf5和Rf6两对核基因控制，其中Rf5已克被隆，Rf6被定位在第8染色体上。本研究利用YTA/9311F2 群体中的交换单株P1为父本，YTA为母本成功构建恢复基因Rf6的F2遗传群体，将Rf6精细定位在第8染色体物理距离约为40Kb的范围内。通过引物延伸和环化PCR等实验，确定了恢复基因Rf6对不育基因转录本的精确剪接位点，并创制出聚合多恢复基因的水稻材料，为红莲型杂交水稻发展奠定了坚实的基础。