鼠伤寒沙门氏菌耐药调控蛋白RamA对自动诱导子AI-2的分子调控机制

RamA is a required element in the development of multidrug resistance of Salmonella enterica serovar Typhimurium. The overexpression of RamA led to decreased expression level of the invasion-related genes (invF, sipA and prgH) in Salmonella pathogenicity island 1. In the autoinducer AI-2 system the regulator LsrR is a required element for the expression of these invasion-related genes and the promoter region of lsrR contains a similar rambox. In the research, the function of AI-2 was first confirmed in the regulation of RamA to the virulence genes by construcing an AI-2 detection reporter strain and gene knockout. Secondly, the role of multidrug resistance effluxs (AcrAB-TolC and MdtK) in the transport of AI-2 from cytoplasm to niche and the regulation mechanism of RamA to lsrR were decided by RT-PCR, gene knockout, chromosome fusion and EMSA experimen. At last, LsrR was inactivated in clinical isolates of multidrug resistance Salmonella enterica serovar Typhimurium and then, the invasion ability of the mutants to cell were tested. In summary, the research will clarify that RamA lead to the change of invasion ability of Salmonella enterica serovar Typhimurium to cell dependent of AI-2 system. The result will give a theoretical basement in predicting the virulence change in the development of multidrug resistance of Salmonella enterica serovar Typhimurium and provide a good direction in screening new drug target and the prevention and cure of clinical isolates of multidrug resistance bacteria.

RamA是鼠伤寒沙门氏菌产生多重耐药的必要元素，RamA过表达可导致沙门氏菌毒力岛1内侵袭力相关基因（invF, sipA 和prgH）表达水平下降。自动诱导子AI-2调节蛋白LsrR是上述基因表达的必要成分且lsrR基因启动子区含有一个相似的RamA结合盒。本课题通过构建AI-2检测报告菌和基因失活技术，首先确定AI-2在RamA对侵袭力相关基因表达中作用。其次，通过RT-PCR、基因失活、染色体融合、体外EMSA实验，确定RamA调控多重耐药泵（AcrAB-TolC和MdtK）在AI-2外排中作用和RamA对lsrR调控机制。最后，将LsrR在临床多重耐药鼠伤寒沙门氏菌体内失活并检测失活株对细胞侵袭能力。本研究将阐明RamA如何调节AI-2系统从而导致细菌侵袭力改变，将为鼠伤寒沙门氏菌多重耐药产生过程中毒力变化提供首个理论基础，为药物新靶标筛选和临床多重耐药菌防治提供有益指导。

鼠伤寒沙门氏菌是导致人和动物发病的一类重要食源性病原菌，RamA是鼠伤寒沙门氏菌多重耐药泵的一个重要增强子。 AI-2 是细菌分泌的一个密度感知自动诱导子，当其达到一定浓度时，进入到细菌体内调整相关基因表达，从而使细菌群体行为（细菌毒力，生物被膜形成等）发生改变。本研究首先利用启动子检测质粒PKP302在鼠伤寒沙门氏菌（ST, CVCC541）中建立自动诱导子AI-2检测体系，检测RamA存在、缺失及过表达条件下，细菌所产AI-2数量的相对变化，同时测定密度感知系统主要蛋白LsrR, LuxS和LsrK在RamA存在及缺失条件下，AI-2数量变化。其次，通过RT-PCR检测RamA对所选蛋白编码基因及多重耐药泵表达水平影响，并确定多重耐药泵在AI-2外排中作用。随后，纯化RamA蛋白，通过ENSA技术检测RamA是否结合在所选蛋白编码基因启动子区。最后，检测RamA调控的密度感知系统蛋白对临床鼠伤寒沙门氏菌毒力基因表达水平影响及在细胞侵袭过程中作用。结果：构建的AI-2检测菌STΔLuxS PKP302::lsrA在加入不同AI-2无菌上清后，所测化学发光值与AI-2数量呈正相关。RamA缺失时，细菌所产AI-2数量相对母体菌显著降低，过表达时，AI-2数量显著升高。LsrR, LuxS和LsrK缺失时,仅LsrR缺失导致AI-2数量降低，其它两个蛋白缺失导致AI-2数量上升。当RamA和LsrR共同缺失时，AI-2数量近一步降低。同时，RamA缺失导致lsrR表达水平相对ST下降6.67倍，其过表达导致lsrR表达水平相对STΔRamA升高了6倍。在ST菌中，AcrB, AcrF 和TolC对细菌AI-2含量没有显著影响，MdtK, AcrD和MacB对AI-2含量有显著影响。EMSA实验结果表明，随RamA浓度增加，lsrR启动子区移动受阻，当RamA浓度达到3668ng后，可完全阻滞lsrR启动子移动。在临床分离的鼠伤寒沙门氏菌中，LsrR缺失可降低6株细菌（环丙沙星MICs>0.5 g/L）毒力基因invF, sipA 和prgH的表达水平，相反可提高4株细菌（环丙沙星MICs< 0.1 g/L）上述毒力基因的表达水平。同时，LsrR缺失也可影响细菌对MDCK细胞的侵袭能力。 总之，本研究首次证实RamA可结合在lsrR的启动子区提高其表达水平，从而抑制A