猪血凝性脑脊髓炎病毒早期感染N2a细胞后差异基因的筛选和鉴定

Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus (PHEV) with a high neurotropic, mainly infects with the central nervous system, causing nonsuppurative encephalitis in brain, leading to structural and functional abnormalities of nerve tissue and occursacute death. Some studies about the damage mechanisms of nervous system caused by neurotropic viruses showed that the gene expression profile of nerve cells changed and the differentially expressed genes played an important role in the process of viruses infection and pathogenicity. In order to explore the role of differentially expressed genes of the nerve cells in PHEV infection, the differentially expressed genes of N2a infected with PHEV will be screened by suppression subtractive hybridization (SSH). The role of target differentially expressed genes in the the PHEV infection process will be validated by RNAi and overexpression. The gene level mechanism of nervous system damage infected with PHEV will be revealed and the antiviral targets for PHEV will be screened. This study will be established the theoretical basis for the diagnosis and treatment of hemagglutinating encephalomyelitis.

猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）具有高度的嗜神经性，主要侵害中枢神经系统，引起脑组织出现非化脓性脑炎等损伤性病理变化，导致宿主的神经组织结构和功能异常而发生急性死亡。对一些嗜神经病毒致神经系统损伤机制的研究发现，病毒在感染后能够引起神经细胞基因表达谱发生改变，这些差异表达基因在病毒感染和致病过程中发挥着重要的作用。为了探索PHEV感染神经细胞后差异表达基因的作用，本项目拟应用抑制性消减杂交技术（SSH）建立PHEV感染N2a细胞特异性cDNA消减文库，筛选感染宿主细胞中差异表达基因；通过构建目标差异基因的过表达和RNAi载体，验证其在PHEV致神经细胞损伤过程中的作用。该项研究不仅有利于解析PHEV致神经系统损伤分子机制，而且将为进一步筛选抗PHEV药物作用靶点奠定基础，从而为针对猪血凝性脑脊髓炎的诊断和防治的研究提供新思路。

猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）具有高度的嗜神经性，可导致宿主的神经组织结构和功能异常而发生急性死亡。为了阐明PHEV致神经系统损伤的机制，本项目通过研究PHEV感染后神经细胞表达谱的变化，筛选差异基因，并研究其在病毒感染过程的表达规律变化和在病毒致病过程中的作用。本项目主要进行了以下的研究：（1）采用转录组学的方法，分别筛选小鼠大脑神经元细胞和神经母细胞瘤（N2a细胞系）感染PHEV后的差异基因。（2）通过荧光定量、免疫组织化学法和Western Blot方法检测体内外差异基金在PHEV感染的不同时段表达规律的变化，及其与病毒载量相互关系。（3）研究相关信号通路的关键基因在PHEV感染过程对细胞凋亡的影响。结果显示：（1）PHEV感染后多种基因呈现差异表达。对PHEV感染N2a细胞的差异基因进行生物学分析，上调基因主要与细胞的有丝分裂和细胞对刺激的反应相关，如细胞的有丝分裂，微管与微丝的粘附等；下调基因主要与神经细胞发育与免疫相关。对PHEV感染小鼠后的差异基因进行分析，上调基因主要与免疫过程等相关，如免疫反应过程，免疫效应过程，先天性免疫反应和应激反应；下调基因主要与神经病理性过程等相关，如神经冲动的传导，神经系统发育，突触的传递。对PHEV感染小鼠和N2a细胞后的差异基因进行对比分析，选取转录活性因子3（ATF3）、抗病毒蛋白MX1和神经细胞粘附因子（NCAM）等基因及其相关基因和信号通路进行下一步研究。（2）在PHEV感染小鼠和N2a细胞后，ATF3和MX1基因随着病毒载量的增加，其表达也增加，并呈正相关的关系。NCAM的表达量与病毒载量之间没有相关性。进一步对ATF3在JNK信号通路中的上游基因ATF2、smad3等进行检测，其表达量与ATF3的表达也呈正相关。推测ATF3的表达是受JNK信号通路调控。（3）对上述推测进行验证，说明JNK信号通路在PHEV感染过程中起着关键作用，可导致感染PHEV后的神经细胞凋亡发生改变。该研究有助于阐述PHEV的致病机制，为猪血凝性脑脊髓炎的防治研究提供新思路。