从TRP超家族角度探讨kca3.1调控系膜细胞收缩的分子机制

[Ca2+]i紧密控制着系膜细胞(MC)的收缩，而维持MC正常收缩舒张功能是保证足够肾小球滤过面积和肾血流量的重要前提。瞬时受体电位(TRP)超家族是控制Ca2+内流 的主要离子通道。我们前期研究显示抑制kca3.1能减少[Ca2+]i，但具体机制尚不清楚。本课题采用分子生物学方法与膜片钳技术相结合，先观察静息与收缩的MC上 kca3.1与TRP家族TRPA1和TRPC1两种亚型的表达变化；再结合体视学方法三维立体观察MC表面积密度等形态学指标变化与Kca3.1、TRPC1和TRPA1通道开放频率等电生理参数及[Ca2+]i改变之间的相关性；最后阻断IgA大鼠体内kca3.1作用，采用鼠超声仪观察肾血流，并检测肾脏病理、胶原分泌及kca3.1,TRPC1,TRPA1的表达变化。以期从离子通道角度阐释kca3.1通道抑制对MC收缩功能的影响及信号机制,为防治肾小球硬化寻求新的治疗靶点。

目的：从TRPC通道角度探讨Kca3.1参与系膜细胞收缩的机制。方法：本课题：1.首次采用免疫荧光探讨TRPC通道TRPC3/6/7和TRPC1、4/5亚型（TRPC2在人类为假基因）在肾脏系膜细胞上的定位、表达；采用Westerblot 和 RT-PCR技术观察在静息与血管紧张素Ⅱ刺激状态下TRPC1、4/5和3/6/7在系膜细胞上的蛋白表达变化；加用TRPC通道抑制剂SKF96365和Kca3.1通道抑制剂Tram34，采用MTT和流式细胞后对系膜细胞增殖和细胞周期的影响；2. 同时，建立大鼠IgA肾病模型，观察模型组和钙神经酶抑制剂（CaNi）组Kca3.1、TRPC1、4/5和3/6/7及钙神经酶蛋白和mRNA的表达变化； 3.观察中药方剂对系膜细胞周期蛋白和细胞间连接的影响。结果：1. TRPC通道亚型TRPC1和TRPC3/6/7在肾脏系膜细胞上定位于细胞膜； 2. 用血管紧张素Ⅱ不同浓度刺激系膜细胞后，细胞增殖明显，其中100nmol/L作用24小时时增殖作用最明显；同时Westernblot实验结果显示Kca3.1和TRPC3/6/7的表达增多，TRPC1蛋白表达减少，a-SMA和vinculin的表达增多。给予Tram34 后细胞增殖的抑制改变不明显，但SKF96365 可以明显抑制细胞增殖，其中20nmol/L作用24小时时抑制作用最明显。因此通道Kca3.1和TRPC参与了大鼠系膜细胞的增殖，且可能与TRPC1表达下调和TRPC3/6/7表达上调有关；3.建立IgA大鼠模型并给与CaNi（Tac）后，大鼠血尿和蛋白尿明显下降，TRPC3/6/7和CaN表达下降，而Kca3.1和TRPC1、4/5的表达变化不显著；4.中药方剂祛风通络方抑制肾小球系膜细胞增殖、减少阿霉素模型鼠尿蛋白，并改善肾功能，其作用可能与其调节Cx36蛋白及基因表达以及下调周期蛋白cylinD1、CDK2和P21，上调p27的表达有关。结论： 1.Kca3.1与TRPC通道可能参与系膜细胞增殖，可能TRPC3/6/7和Kca3.1形成通道复合物起作用有关；2.Tac可以减少系膜细胞增殖，可能与下调TRPC3/6/7和CaN表达有关，与TRPC1和Kca3.1无关。