中电导钙激活钾通道kca3.1在肾固有细胞间充质转分化过程中的作用研究

中电导钙激活钾通道Kca3.1表达于体内多种类型的细胞，调控细胞增殖和表型转分化，但在肾脏固有细胞间充质转分化过程中的作用尚不清楚。本课题以肾小管上皮细胞和系膜细胞为研究对象，采用RT-PCR等分子生物学方法与膜片钳技术相结合，观察kca3.1通道在正常和增殖的两种细胞上的表达、细胞内定位，通道开放频率、电流幅值、开放及关闭时间等电生理学参数变化，重点分析kca3.1通道的表达与细胞活性、细胞凋亡、胶原分泌和α-SMA、FSP1表达之间的量化关系及Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的改变；应用kca3.1通道阻滞剂阻断大鼠肾纤维化模型体内kca3.1的作用，观测其对大鼠肾功能、纤维化指标及Kca3.1 表达的影响。以期从不同角度探讨Kca3.1在肾小管上皮细胞和系膜细胞间充质转分化发生中的作用和可能机制，本研究的进行将为临床防治肾间质纤维化提供新的治疗靶点，为临床新药开发提供理论依据。

肾脏纤维化是导致慢性肾功能衰竭的主要原因，是肾脏病学界研究的热点和重点领域。既往研究发现钙激活钾离子通道Kca3.1参与肾间质纤维化的发生发展，但与肾小球硬化、对肾脏固有细胞上皮间充质转分化的研究未有报道。本研究自获资助后，根据原实验方案：1.进行体外实验：⑴.培养大鼠肾脏系膜细胞( HZYB- 1) 细胞株和肾小管上皮细胞（NRK-52E）细胞株，采用不同浓度TGF- ß1和血管紧张素Ⅱ诱导细胞增殖，确定TGF- ß1和血管紧张素Ⅱ诱导浓度分别为2ng/ml、100nM，作用时间为48h。⑵.采用流失细胞技术、MTT方法、western-blot和RT-PCR等分子生物学技术，观察不同浓度TRAM-34对细胞增殖的作用，结果发现：16nM的TRAM可以将系膜细胞阻滞于G0-G1期，细胞增殖减弱，与增殖和上皮细胞间充质转分化相关的α-SMA、FSP-1和Kca3.1蛋白和mRNA均有显著下降（P＜0.05），细胞分泌胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Fibronectin均有改变（数据统计中）；⑶.采用激光共聚焦和免疫荧光技术，确定Kca3.1在系膜细胞和肾小管上皮细胞中的定位，结果发现：Kca3.1位于细胞浆中，TGF-β(2ng/mL)可快速刺激系膜细胞内Ca2+升高。TGF-β刺激的细胞内Ca2+升高表现为峰型升高，给予TRAM34 16nM后细胞内Ca2+升高快速被抑制。⑷.采用电生理膜片钳技术观察系膜细胞和小管上皮细胞上Kca3.1的电生理学变化，结果证实：在系膜细胞上记录到中电导钙激活钾通道(KCa3.1)，该通道电导55ps；小管细胞的电生理学特性正在进行中。2.体外实验：建立SD大鼠IgA肾病模型和UUO大鼠模型，大鼠24小时尿蛋白和血尿明显，其中采用免疫荧光技术检测，肾小球系膜区有IgA沉积，证明IgA肾病模型造模成功。后续实验结果正在统计中。3.通过体内、体外实验结果，kac3.1参与了肾小球硬化的发生、发展，可能与其参与了系膜细胞和小管上皮细胞间充质转分化有关。4.采用祛风通络方剂和新型抗纤维化药物（sorafenib）分别作用于体外培养的系膜细胞和肾小管上皮细胞，以及UUO模型大鼠，发现均对细胞增殖和纤维化具有抑制作用，但是否通过Kca3.1通道，实验正在进行中。5.在本实验基础上，课题组成员申请国家自然科学基金青年项目1项，其他基金2项，培养学生2名。