突变亨廷顿蛋白对细胞内游离锌离子水平的影响及其机制

亨廷顿病(Huntington's disease, HD)是一种由HD基因突变所致的遗传性神经退行性疾病。突变的HD基因产物突变亨廷顿蛋白（huntingtin, htt）可通过影响基因表达产生细胞毒性。锌离子可以作为凋亡抑制因子而对细胞有保护作用，参与生长因子介导的细胞增殖和生长途径的调控。细胞内游离锌离子的浓度受ZNT3的水平影响，ZNT3还能保护细胞抵抗由锌缺失引起的细胞损伤。以往的研究揭示锌离子内稳态异常可能参与了神经退行性疾病的发病。在HD中，突变htt是否影响细胞内锌离子水平不清楚。我们的前期工作发现，HD转基因小鼠纹状体和海马神经元内游离锌离子、ZNT3蛋白质及mRNA的表达均显著降低，提示突变htt可能通过影响ZNT3的表达而影响细胞内游离锌离子水平。本项目拟以HD转基因小鼠、表达突变Htt的细胞系和原代神经元观察突变htt对细胞内游离锌离子水平的影响及其分子机制。

亨廷顿病（huntington’s disease, HD）是一种由其基因第一外显子中CAG序列异常重复（大于36个）所致的神经退行性疾病。HD患者临床症状表现为运动失调，认知紊乱和心理障碍。突变的亨廷顿蛋白（huntingtin, Htt）对神经元突触功能损伤是引起HD早期症状和晚期细胞死亡的主要原因。 锌是体内重要的微量元素之一，发挥多种生理功能。脑组织内游离锌主要位于谷氨酸能神经元的突触小泡中，参与调节突触传递。生理浓度的锌有神经保护作用，然而，高浓度的锌有神经毒性。此外，锌的缺乏影响神经系统的发育和引起神经元的凋亡，最终导致学习和记忆损伤。因此，囊泡锌稳态的失常能引起多种神经功能损伤并促进神经退行性疾病的发生。囊泡锌的量与锌转运体3（ZnT3）的水平密切相关。本项目利用HD转基因小鼠和转染表达突变Htt的细胞模型，观察了突变Htt对游离锌离子水平的影响及其机制，结果显示：1. HD转基因小鼠脑内游离锌离子水平降低：金属自显影(AMG)技术光镜和电镜结果均显示，HD小鼠中皮质、海马、纹状体、外侧苍白球、内侧苍白球和黑质等部位游离锌离子表达较野生型（WT）小鼠相应脑区显著降低。2. 突变htt下调ZnT3表达：与WT小鼠比较，HD小鼠皮质、纹状体、海马等脑区的ZnT3蛋白质表达在14周已经明显降低，在18周和20周降低更加明显；与转染正常Htt（20 Q）的BHK细胞比较，转染突变Htt（160 Q）的BHK细胞中ZnT3蛋白表达水平在转染24 h后降低，转染48 h和72 h后降低更为明显。RT-PCR检测显示，HD小鼠皮质、纹状体、海马等脑区和转染表达突变Htt的BHK细胞中ZnT3 mRNA水平的变化与蛋白水平变化一致。 3. Sp1 调控ZnT3基因转录：用双荧光素酶报告基因检测和染色质免疫共沉淀技术检测结果提示转录因子Sp1可与ZnT3基因启动子上的（-338~-232 bp）和（-253~-112 bp）基序结合来激活ZnT3基因的转录。4. 突变Htt抑制Sp1和ZnT3基因启动子序列的结合：突变Htt可通过影响Sp1与ZnT3基因启动子序列的结合能力，下调ZnT3的表达，降低游离锌离子水平，最终可能导致HD中神经元突触功能损伤。上述结果在第14界国际组织化学与细胞化学会议上交流汇报。