miR-200b参与RMP-7介导开放血肿瘤屏障机制的研究

RMP-7开放血肿瘤屏障紧密连接，在临床前期试验中取得良好效果，但机制不清。前期工作证明RMP-7使脑微血管内皮细胞miR-200b表达显著增高，miR-200b可能对紧密连接相关蛋白occludin和Ras鸟苷酸结合蛋白RND3基因起转录后调控作用；RND3可能通过与p190BRhoGAP蛋白互作改变RhoA活性，引起细胞骨架重排。本项目拟首先验证miR-200b通过"种子区"与occludin和RND3基因的直接作用和关键结合位点；进一步建立miR-200b过表达和表达沉默的BTB模型，明确miR-200b对occludin和RND3表达和功能调节；最后研究p190BRhoGAP是否被ROCK磷酸化，导致RND3与p190BRhoGAP结合减少，p190BRhoGAP活性减弱，引起BTB开放。本研究不仅为RMP-7开放BTB机制提供新的理论依据，而且能够为脑胶质瘤的治疗提供新靶点。

Luc报告基因分析，初步确定miR-200b能够与occludin和RND3的3’UTRs区域结合；进一步验证上述基因的直接作用和关键结合位点。.发现miR-200b过表达hCMEC/D3中occludin和RND3低表达，BTB通透性降低，miR-200b表达沉默的结果相反。免疫共沉淀检测RND3和ROCKII蛋白相互作用，发现miR-200b过表达RND3和ROCKII蛋白结合增多；miR-200b表达沉默结果相反。ROCKII能够磷酸化p190BRhoGAP，减少RND3与p190BRhoGAP结合，进而减弱p190BRhoGAP活性，激活RhoA，引起BTB开放。.应用ROCK的特异性抑制剂Y-27632预处理大鼠原代脑微血管内皮细胞后，发现Y-27632显著抑制缓激肽诱导BTB通透性升高， ZO-1重分步， F-actin重排。.RMP7处理BTB模型后， BTB通透性升高， hCMEC/D3中的miR-200b低表达。.miRNA-200b mimic和miRNA-200b inhibitor成功的转染到hCMEC/D3中，分别显著上调和下调其表达。过表达miRNA-200b能够恢复BTB的完整性和降低BTB的通透性，mimic组结果相反。mimic组的occludin和claudin-5蛋白从在细胞膜不溶性成分转换到细胞内可溶性成分显著减少；inhibitor组结果相反。F-actin、occludin 和 claudin5主要分布在细胞边缘，inhibitor组，应力纤维形成，伴发occludin 和 claudin5由细胞膜进入到细胞质和细胞核；mimic组观察结果相反。.RMP7处理BTB模型后，hCMEC/D3中RhoA和ROCKII mRNA 和蛋白呈现时间依赖式增高。mimic组的RhoA 和 ROCKII 的mRNA 和蛋白表达降低，分布减少； inhibitor组的结果相反。.Luc报告基因分析，证明miR-200b抑制RhoA and ROCKII的3’-UTR功能。构建突变型RhoA 和 ROCKII LUC载体，荧光素酶活性没有变化。以上结果证明miR-200b直接作用RhoA 和 ROCKII的3’UTR。.2篇标注项目基金号的中文核心期刊论文发表。