ATM对人脐带间充质干细胞微囊抑制胱肿瘤细胞生长的调控机制研究

In our previous study, we had showed microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal Wharton's Jelly stromal cells (hWJMSC-MVs) inhibit bladder cancer cells proliferation and induce apoptosis. However, the mechanisms defining cancer cells fate upon ATM （Ataxia telangiectasia mutated kinase）/p53 activation are poorly understood. There were researchs reported that down-regulation of ATM protein sensitizes cancer cells to stress-induced apoptosis. Herein, we hypothesized that ATM express level before treatment of hWJMSC-MVs may be one of the key factors controling cancer cells fate. To explore the regulatory mechanism of ATM upon hWJMSC-MVs attenuating bladder cancer cells growth, we will alter ATM protein express using pharmaceuticals and RNA interfering technique, and then analysize the consequent effect variations of hWJMSC-MVs on bladder cancer cells growth and express or activation of major target proteins of ATM/p53. This study will lay a sound foundation for microvesicles application for cancer therapy in clinical.

本项目前期研究发现，人脐带间充质干细胞微囊可以经ATM/p53通路抑制膀胱肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。但ATM/p53激活后如何调控肿瘤细胞以周期停滞为主或以凋亡为主的机制目前仍不清楚。有研究表明，ATM低表达的肿瘤细胞接受射线、化学药物等处理更容易被诱导凋亡。因此我们假设肿瘤细胞接受微囊处理前ATM基础表达水平是决定肿瘤细胞命运的关键调控因素之一。本项目中，我们首先通过ATM特异性抑制剂、激活剂及RNA干扰技术改变ATM基础表达水平，然后分析微囊处理膀胱肿瘤细胞后肿瘤细胞周期停滞与凋亡指数的变化及ATM/p53通路中主要靶点蛋白的活化、表达水平的改变。以此来探讨ATM对人脐带间充质干细胞微囊抑制膀胱肿瘤细胞生长的可能调控机制。这为将来临床上微囊治疗肿瘤奠定良好的实验基础。

本项目前期研究发现,人脐带间充质干细胞微囊（hWJMSC-MVs）可以经 ATM/p53 通路抑制膀胱肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。但ATM/p53激活后如何调控肿瘤细胞以周期停滞为主或以凋亡为主的机制仍不清楚，关于肿瘤侵袭和转移以及自噬的作用还不明确。本项目中，研究发现KU55933 及 Chloroquine 处理 T24 细胞后 ATM 分别出现了相应的表达下调和上调，采用 hWJMSC-MVs 处理 T24 细胞可以引起 T24 细胞 G0/G1 阻滞及诱导凋亡， Western blot 检测提示 p-ATM、p- p53、p21 及 cleaved casepase 3/8 表达上调。另外, 我们将 KU55933 预处理的T24 细胞暴露于 hWJMSC-MVs后再进行检测发现，伴随p-ATM、p53、p21下调表达而cleaved-caspase3、bax上调表达，T24 细胞周期阻滞的比例有所减少，而更多地表现为凋亡趋势。同时，在T24肿瘤动物模型中，研究发现采用shRNA干扰ATM表达后hWJMSC-MVs可以更加明显地抑制膀胱肿瘤细胞的生长。体内、体外的研究结果说明ATM的基础表达水平是决定接受hWJMSC-MVs处理的T24细胞命运的关键调控因素之一。为后期提高hWJMSC-MVs的临床应用效果奠定了理论基础。此外，我们采用划痕实验发现hWJMSC-MVs可以在体外抑制膀胱肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。进一步的分子机制研究提示，该过程中MMP-9、MMP-2 的表达水平明显降低， E-cadherin 表达水平升高，EMT 相关的转录因子 ZEB1 及 Snail 表达水平降低，说明 hWJMSCs-MVs通过抑制EMT抑制了T24 细胞的侵袭和转移。另外，研究发现 hWJMSC-MVs 明显下调 了 p-AKt 和 p-mTOR 信号通路，上调了 Beclin1、Atg5-Atg12表达。 结果说明 hWJMSC-MVs 通过抑制 Akt/mTOR 信号通路诱导T24 细胞产生自噬现象并促进了凋亡。我们荟萃分析发现围手术期输血(PBT)明显增加了接受膀胱全切的膀胱癌患者围手术期各种原因的死亡率、肿瘤特异性死亡率及肿瘤的复发风险。我们综述了 miRNAs 对细胞凋亡、细胞周期及上皮间质转化过程的调控作用以及前列腺癌干细胞和雄激素受体通路中的作用。