解淀粉芽孢杆菌BG-09中胞苷的分泌模式及其分子调控机理研究

Cytidine is an anti-tumor, antiviral good intermediates, also can be used as functional nucleotides food ingredients,and its demand is growing fast. It mainly obtained by microbial fermentation. Enhancing secretion of cytidine is one of the main approaches to improve cytidine fermentation production by Bacillus amyloliquefaciens, however, its molecular mechanism is still unclear. Using the research methods of cytidine metabolic theory and metabolic engineering, Bacillus amyloliquefaciens BG-09 will be used as initial strain to investigate the effects and molecular regulation mechanism of membrane transport proteins, the bacterial cell membrane, and environmental factors on secretion system of cytidine by using the methods of metabolic engineering, gene editing technology, fluxomics and metabonomics technology. Uracil permease and nucleoside transporter NupC, phosphatidylglycerol phosphate synthase, ethanolamine kinase and phospholipase and environmental factors as the research object, influence of regulating factor on the secretion of cytidine, cell growth, metabolic flux during cytidine secretion will be analyzed. And, an assumed modes of cytidine secretion will be established. The Secretory manner. theoretical maximal cytidine synthesis capability and molecular regulation pathway of cytidine metabolic homeostasis will be interpreted. The interactions between the various metabolic regulation factors and coordination regulation effect on cytidine secretion will be expounded. The molecular regulation mechanism of cytidine secretion system will be revealed. Therefore, it is very important to academic significance and application value in optimization of cytidine maximum capacity on molecular level, molecular genetics, breeding research of producing-cytidine strain.

胞苷是生产核苷酸类功能性食品的原料，也是制造药物的中间体，市场需求量大，主要通过微生物发酵获得。增强胞苷分泌是提高胞苷发酵单位的主要途径之一，但其分泌模式和分子调控机理尚不清楚。本研究运用胞苷代谢理论与代谢工程的方法，主要研究解淀粉芽孢杆菌BG-09中胞苷的分泌模式及其分子调控机理。拟采用基因编辑技术、流量组学和代谢组学技术，重点研究膜运输蛋白（尿嘧啶通透酶和核苷转运蛋白NupC）、细胞膜合成关键酶（磷脂酰甘油磷酸合成酶、乙醇胺激酶和磷脂酶）与环境因素（代谢调节剂、金属离子、表面活性剂）等调节因子在胞苷分泌过程中的作用，分析调节因子对细胞生长、代谢通量与胞苷合成的影响，提出胞苷分泌的假定模式，诠释胞苷的分泌方式及调控代谢稳态的分子途径，阐明菌株内调节因子间的相互关系及其对胞苷分泌的协同作用机理，揭示胞苷分泌过程的分子调控机理，为从分子水平上优化解淀粉芽孢杆菌的胞苷最大生产能力提供理论依据。

胞苷是合成多种抗病毒、抗肿瘤药物的中间体，也可作为核苷酸类保健食品和功能性食品的原料，主要通过微生物直接发酵法获得。菌体细胞膜对发酵过程中胞苷的分泌有重要影响。本项目利用分子遗传学、细胞生物学、微生物功能基因组学和代谢工程的方法，通过基因编辑技术、流量组学、代谢组学、基因功能验证及环境因素调控等实验技术手段，重点研究了解淀粉芽孢杆菌BG-09中胞苷分泌模式和重要代谢调节因子如表面活性剂、金属离子等对胞苷分泌的调控机理，分析了与胞内物质外排密切相关的调节因子与产物积累的变化关系，表明编码膜蛋白的psd基因参与胞苷向胞外转运过程，相比出发菌株B. amyloliquefaciens BG-09 的胞苷产量提高了18.07%，表明psd基因过表达对胞苷发酵有促进作用，能够改变菌体细胞膜的通透性；发酵过程中添加表面活性剂对胞苷发酵产生积极作用，结果发现，非离子表面活性剂Tween-80添加量对胞苷发酵有明显的影响，添加量在低于5 g/L时，对菌体生长影响不大，耗糖速率呈下降趋势，但发酵液中胞苷浓度增加，在3 g/L时、发酵40 h后，胞苷浓度为1.696 g/L，是对照组的2.42倍。用代谢网络理论将细胞中的胞苷代谢生化反应以网络整体来考察，优化细胞所能达到的最大胞苷合成能力和胞苷的输出途径，提高了胞苷的合成浓度；最终通过DNA重组、基因定向改造等技术，串联表达pyrP和NupC基因，与对照菌株相比胞苷产量有了大幅度提高，表明这两个基因在胞苷分泌过程中发挥着协同促进的作用；根据实验观察结果挖掘原有分泌系统中未包含的新的关系信息，得出尿嘧啶通透酶和核苷转运蛋白在胞苷分泌中起着直接作用，细胞膜蛋白有着重要间接影响，找到人为控制胞苷分泌过程的4个突破点，获得了胞苷分泌系统的分子调控途径。因此，开展胞苷分泌调控机理的研究，不仅能拓宽核苷发酵理论研究的思路，也为进一步构建具有高效合成能力的产胞苷工程菌株奠定理论基础，对于胞苷生物合成调控机理的深入研究和国民经济的发展均具有重要的意义。