解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子对胞苷过量合成的转录调控机制研究

Cytidine is an anti-tumor, antiviral good intermediates, also can be used as health food ingredients. With the increasing of cytidine market, the large-scale production of cytidine by microbial fermentation method has become a major way to solve this problem. While improving cytidine production, the regulation of pyr operon is essential to the excessive synthesis cytidine, however, its transcriptional regulation mechanism is unclear. Bacillus amyloliquefaciens will be used as initial strain to investigate reconstruction of negative transcriptional regulation system to achieve the modification of cytidine synthesis pathway. Attenuator and regulatory protein PyrR as the research object, effects of transcriptional regulation on cytidine biosynthesis will be analyzed. Relationship between pyr operon and cytidine synthase gene transcription, expression and metabolic flux distribution will be studied using RT-PCR, two-dimensional electrophoresis, metabolic control analysis. Ttranscriptional regulation mechanisms of pyr operon to cytidine excessive synthesis will be revealed. A goal will be achieved by removing the limiting factors，expanding metabolic pathways in the cytidine biosynthesis and increasing the yield of cytidine. Therefore, it is very important to academic significance and application value in molecular genetics and breeding research of producing-cytidine strain.

胞苷是抗肿瘤、抗病毒药物良好的中间体，也是核酸类保健食品的原料。随着胞苷市场需求的日益增大，采用微生物发酵法大规模生产胞苷已成为解决这一问题的首选途径。在提高发酵单位高效生产胞苷过程中，嘧啶操纵子的调控对胞苷的过量合成至关重要，然而其转录调控效应及关联机制尚不清楚。本项目以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，拟采用基因重组对嘧啶操纵子负转录调控系统进行重构来实现胞苷合成途径的改造，以弱化子与调节蛋白PyrR为研究对象，分析其对胞苷生物合成转录调控的影响；运用RT-PCR、二维电泳技术、代谢控制分析等方法系统地研究操纵子与胞苷合成酶基因的转录、表达及代谢流分布的关系，揭示嘧啶操纵子对胞苷过量合成的转录调控机制，以实现解除负调控因素、增加胞苷合成酶表达量的目标，为构建胞苷合成的理想载流途径奠定研究基础。

胞苷是抗肿瘤、抗病毒药物良好的中间体，也可作为保健食品的原料。随着胞苷市场需求的日益增大，采用微生物发酵法大规模生产胞苷已成为解决这一问题的首选途径。在提高发酵单位高效生产胞苷过程中，嘧啶操纵子的调控对胞苷的过量合成至关重要。本项目以解淀粉芽孢杆菌为出发菌株，采用基因重组对嘧啶操纵子负转录调控系统进行重构来实现胞苷合成途径的改造，以弱化子与调节蛋白PyrR为研究对象，分析其对胞苷生物合成转录调控的影响；运用RT-PCR、双向电泳技术、代谢控制分析等方法系统地研究操纵子与胞苷合成酶基因的转录、表达及代谢流分布的关系。利用构建的CRISPR-Cas9基因敲除系统成功改造了解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子的调节蛋白PyrR和弱化区域，通过转录分析和基因表达等方法，研究发现pyrR基因敲除后导致操纵子中第三个结构基因pyrB编码的天门冬氨酸转移酶的表达量显著增加，胞苷合成途径中结构基因的转录水平和表达剂量均有明显提高，说明操纵子转录调控与胞苷过量合成之间呈现出正相关关系，菌株中胞苷的合成受到嘧啶操纵子中调节蛋白PyrR对pyr操纵子结构基因表达的调控及弱化子对操纵子的转录调控。研究结果表明，敲除弱化子基因或PyrR失活后，培养基中UMP、UDP和UTP的浓度变化均对操纵子的转录水平无明显影响，而操纵子转录水平显著提高、发酵液中的尿苷与胞苷的浓度水平明显增加。基于物料的质量守恒定律和代谢反应中间代谢物的拟稳态假设，结合发酵过程曲线，研究了胞苷发酵过程不同阶段代谢流分布的影响。pyrR基因敲除可引发解淀粉芽孢杆菌细胞内的代谢流迁移，增大了嘧啶合成途径的代谢通量，对胞苷合成代谢流的促进具有显著提高效果。研究了pyrR基因和弱化子基因敲除对解淀粉芽孢杆菌胞苷合成途径中关键酶和胞苷产量的影响，分析了63个差异蛋白点，对其中19个不同蛋白质功能类别分析发现，pyrR基因敲除会促使操纵子结构基因、与能量生成及转运相关的蛋白以及糖酵解途径和溢流代谢相关的蛋白表达上调，同时也促使参与辅酶或者辅基代谢的蛋白表达发生显著变化。项目的实施揭示了嘧啶操纵子对胞苷过量合成的转录调控机制，以实现解除负调控因素、增加胞苷合成酶表达量的目标，为构建胞苷合成的理想载流途径奠定研究基础。