口腔黏膜下纤维性变免疫相关致病因子的筛选与功能研究

Oral submucous fibrosis (OSF) is a chronic and insidious oral mucosal disease, which results from habitual chewing of betel quid and always carries a high risk of transition to oral cancer, detrimental to human health. The pathogenic mechanisms of OSF are still unknown. Recent researches suggest that immune factors may have functioned as an important element in the occurrence and development of OSF. But still, no key immune-associated pathogenic factors have been identified. This project resorts to antigen-antibody reactions, combined with high throughput immunoproteomics and serological identification of antigens by recombinant expression cloning, to screen the antigens preferably recognized by immune system in OSF tissues. On the basis of bioinformatics retrieval, we could further research 3-4 eligible key antigens identified in previous experiments as well as their correlativity with clinical pathologic parameters by adopting gene cloning, protein expression and purification, monoclonal antibody, RT-PCR, immunoblotting and RNA interference techniques. Afterwards, their biological characteristics and functions in the pathological mechanisms of OSF would be properly explored, hence certifying their possibility to function as new therapeutic targets and initiating a novel perspective for OSF treatment.

口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是一种由长期咀嚼槟榔习惯导致的具有潜在癌变危险性的慢性、隐匿性口腔黏膜疾患，严重危害人类健康。OSF致病机制尚不明确，近年来的研究表明免疫因素可能在OSF的发生与发展过程中具有重要作用，但尚未发现与OSF免疫相关的关键致病因子。本课题以抗原抗体特异性反应为切入点，联合应用高通量的免疫蛋白质组和重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术筛选OSF组织中能被机体免疫系统优势识别的抗原。在生物信息学检索的基础上，进一步利用基因克隆、蛋白表达与纯化、单克隆抗体制备、逆转录聚合酶链反应、免疫印迹及RNA干扰等分子生物学和免疫学技术对其中3-4个关键候选抗原在OSF组织中表达特征及与临床病理参数的相关性进行研究，并对其生物学特性与功能进行鉴定，有望明确候选抗原在OSF致病机理中的作用及作为治疗靶标的可能性，从而为OSF的治疗提供新的思路

口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是一种由长期咀嚼槟榔习惯导致的具有潜在癌变危险性的慢性、隐匿性口腔黏膜疾患，严重危害人类健康。OSF致病机制尚不明确，近年来的研究表明免疫因素可能在OSF的发生与发展过程中具有重要作用，但尚未发现与OSF免疫相关的关键致病因子。本课题通过人19000点蛋白质芯片筛选出45个OSF免疫性相关抗原。应用生物信息学检索分析，并对所获OSF免疫性相关抗原进行原核克隆表达及蛋白纯化，成功获得28个高纯度重组蛋白。ELISA法进一步验证了该28个OSF免疫性相关抗原的免疫反应性，结果与蛋白芯片检测一致。RT-qPCR检测发现8个OSF免疫性相关抗原（PTMA，NOL3，ZNF428，NASP，AAMP，DTNBP1，GORASP1，CALR）在OSF成纤维细胞的表达均显著高于对照组（p<0.05），western blot方法进一步检测发现PTMA的蛋白表达水平在OSF病例组显著高于正常对照组。因此我们进一步探讨了PTMA在口腔黏膜成纤维细胞纤维化过程中的作用。RT-qPCR检测52例OSF组织及16例正常黏膜组织TGF-β1、SMAD4以及Collagen I的表达，发现上述基因的mRNA在OSF组织中的表达均显著高于正常对照组，且与PTMA表达正相关。为研究PTMA在TGF-β1诱导口腔黏膜成纤维细胞纤维化过程中的作用，我们构建了PTMA干扰siRNA质粒，并应用TGF-β1诱导构建了口腔黏膜成纤维细胞的纤维化模型，利用免疫印迹及细胞转染等分子生物学和免疫学技术检测TGF-β1诱导前后细胞的增殖以及纤维化标志物蛋白TIMP1、MMP9、α-SMA、Collegan1，和SMAD4的表达。结果发现干扰PTMA表达能够下调TGF-β1所诱导成纤维细胞的增殖，且抑制上述纤维化标志物蛋白的表达，提示PTMA能够通过调控TGF-β1/SMAD4信号通路促进OSF组织纤维化，这一结果首次明确PTMA在OSF致病机理中的作用及作为治疗靶标的可能性，从而为OSF的致病机制及防治的研究提供了新的思路。