微藻共栖细菌的抑藻作用及基于群体感应的调控机制

本研究是前一个基金"利用群体感应信号诱导海绵共栖细菌产生化学防御物质研究"思路的延续和深化，为解决微藻生消与群落演替过程中共栖细菌的抑藻作用机制问题，结合细菌群体感应现象的前沿领域，在前期研究基础上首次提出微藻共栖溶藻细菌通过群体感应（QS）系统调控产生溶藻物质的论点。以我国重要赤潮微藻为研究对象，分离、筛选共栖溶藻细菌，探明溶藻物质，通过溶藻物质代谢过程与细菌的密度关系研究、AHLs类信号分子的检测和解析、LuxI/R同源蛋白调控基因的克隆、溶藻细菌AHLs合成能力缺失突变株的构建及AHLs信号的外加诱导等多方面实验验证微藻共栖溶藻细菌的溶藻作用受到QS系统的调控，从细胞、信号分子和基因水平上阐明溶藻机制。本项目的研究意义在于丰富藻菌相互作用的相关理论，明确溶藻细菌的作用产生机制，进一步加深对细菌群体感应调控功能的认识，并为利用生物调控技术防治赤潮提供新的方法。

本课题为探讨海洋微藻共栖细菌的抑藻作用机制问题，研究了微藻共栖细菌的抑藻活性与其群体感应(QS)系统的关系。从61株海洋微藻中分离获得206株海洋细菌，利用生物传感器方法筛选出11株细菌具有基于AHLs的QS系统。通过GC-MS检测，它们都含有C8-HSL信号分子，部分含有C6-HSL和C14-HSL，其中9株细菌具有抑藻活性，分别对东海原甲藻、棕囊藻、海链藻和赤潮异湾藻具有不同程度的抑制作用。一株抑藻细菌PD-2因其对宿主（东海原甲藻）具有显著抑藻作用而作为目标藻株深入研究。利用TLC生物自显影技术，探明细菌PD-2至少能产生三种AHLs信号分子，除了C8-HSL，PD-2还含有C12-HSL。建立了基于四爿藻（Tetraselmis sp.）的抑藻化合物跟踪分离筛选模型，通过半制备型HPLC从抑藻细菌PD-2代谢产物中分离纯化出两个抑藻化合物（1）和（4），通过质谱、红外、元素及核磁共振分析，确定了化合物（1）分子式为C23H24BrN2SO5，化合物（4）分子式为C15H13BrO3。经检索，化合物（4）为一新的化合物。此外，对抑藻化合物（4）产生的密度依赖性进行了研究，发现该化合物的产生与细胞密度呈正相关，即证实了抑藻细菌PD-2的抑藻活性具有密度依赖性。通过对细菌PD-2的全基因组测序、基因注释等分析工作，从中找到了两对调控QS的luxR/I同源基因，将它们命名为zla R/I和zlb R/I，从基因水平证明了PD-2具有群体感应系统。课题组建立了利用同源重组方法进行基因敲除的所有技术体系，包括PD-2利福平突变株的筛选，质粒转导体系的建立和验证。同时成功设计了要敲除的目标基因zlb I上下游基因片段的引物，并通过两步PCR技术对上下游基因进行了连接，这些为下一步同源重组双交换敲除目标基因奠定了良好的工作基础，下一步将利用限制性内切酶将上下游连接基因插入到自杀质粒pNTPS138 Kan中，再通过结合方式将该质粒转导入PD-2进行双交换同源重组，以敲除zlb I 基因，考察PD-2突变株的抑藻活性，从而进一步阐明PD-2的溶藻机制与群体感应功能的相关性。