胶原基水凝胶成软骨诱导作用的分子生物学研究

组织诱导性生物材料的提出，可望通过材料的优化设计达到修复组织的目的。前期研究首次证明了胶原基水凝胶材料具有软骨诱导性，但其分子生物学机理尚未可知。本研究拟初步研究胶原基水凝胶诱导软骨形成的分子生物学机制，以胚胎发育时期的软骨形成及生长因子（如TGF-β）诱导间充质细胞成软骨为鉴，将胶原基水凝胶诱导软骨形成划分为三个阶段，分阶段地考察材料诱导作用下关键转录因子及相关信号通路分子的调控作用，具体为：1）细胞聚集阶段中考察与关键转录因子Sox9及 MAPK信号通路的调控作用；2）增殖分化阶段中考察与Sox5、6转录因子及Wnt信号通路的调控作用；3）肥大化阶段中考察关键转录因子Cbfa1及Ihh-PTHrP信号通路的调控作用。通过对材料在早期诱导软骨、后期维持软骨的能力进行全面考察，建立软骨诱导材料与软骨形成机制间的联系，从而确定软骨诱导材料筛选平台，指导材料的优化设计。

本项目分别以软骨形成的关键转录因子sox9、sox5及cbfa1作为标志，分别构建了pcDNA-Sox9-EGFP、pcDNA-Sox5-EGFP、pcDNA-Cbfa1-EGFP质粒，可转染原代培养的大鼠间充质干细胞（MSCs）细胞，在MSCs细胞中sox9、sox5、cbfa1表达上调的时候可发出荧光，从而将软骨形成分为三个时期进行考察：聚集阶段（Sox9表达为主）、分化阶段（Sox5表达为主）、肥大化阶段（cbfa1表达为主）。在各个时期考察胶原水凝胶对MSCs软骨诱导情况，结果表明：（一）II型胶原表达较高，与生长因子诱导效果较为接近，说明胶原水凝胶材料具有软骨诱导作用，可维持软骨表型；I型胶原表达相对较低，说明胶原水凝胶可有效防止软骨去分化。X型胶原未能在各个组中检测到，说明成骨分化倾向轻微。（二）各软骨形成阶段，材料成软骨诱导过程中信号通路的表达情况：1）胶原诱导组Smad2，Smad 3和Smad 4的表达与生长因子诱导组相比，较为接近，但TGF-β的两个受体TβR-II，TβR-I表达较低，说明材料参与调节TGF-β信号通路下游基因。2）胶原诱导组Wnt-5a的表达与生长因子诱导组相比，较为接近，表明材料诱导软骨参与调节Wnt信号通路。3）胶原诱导组PTHrP的表达优于或相近生长因子诱导组，但Ihh的表达量相对较低，表明Ihh-PTHrP信号通路参与了胶原诱导软骨，但是相对于生长因子组表达更低，说明胶原诱导软骨更不易向肥大化方向进行，说明胶原相对于生长因子更能维持软骨细胞表型。4）ERK1/2、p38、N-cadherin、fibronectin等蛋白水平结果表明，在软骨诱导过程中，胶原水凝胶对软骨相关蛋白的表达具有一定的调节作用，因此材料诱导软骨参与调节MAPK信号通路。由此可见，材料具有与生长因子接近的可诱导软骨形成的作用，参与调节了TGF-β下游信号通路、Wnt信号通路、Ihh-PTHrP信号通路以及MAPK信号通路。优化设计材料可实现通过材料直接诱导软骨形成，从而取代生长因子。 （三）不同的材料诱导软骨形成的能力不同。采用非胶原基水凝胶材料，如羟基磷灰石、丝束蛋白等，不能诱导MSCs成软骨。即便胶原基水凝胶，软骨诱导性能也随材料的成分的不同而不同。该部分结果已发表SCI论文2篇。本项目首次对材料诱导软骨分子机制进行研究，目前国内外尚无报道。