Notch1调控Integrin α2影响BMSCs成骨分化及与OP的相关性研究

We found that the decreased Integrin a2, Notch1 expression in BMSCs with abnormal osteogenic differentiation , and there is a close interaction. Accordingly, we propose to further investigate the role and mechanism of Notch1 regulating Integrin a2 on osteogenic differentiation of BMSCs and the relevance to OP.First,we will demonstrate the localization/structural changes by co-immunoprecipitation and laser scanning confocal in human BMSCs during osteogenesis differentiation model.Second,the changes of expression,signal passway,ability of regulate differentiation during Notch1 regulating Integrin a2 will be detected in vivo and vitro models;using the Proximity Ligation Assay system to identify proteins sites that interact with another protein;observing the changes of protein structure and passways in BMSCs that come from osteoporosis patients;verifying the molecular mechanisms of Notch1 regulating Integrin a2 on osteogenic differentiation of BMSCs and the relevance to OP in vivo models.Finally,the project will provide the significant theoretical basis for the research of osteogenic differentiation and OP,and offer new targets for the medicine research and development.

我们发现成骨分化异常的BMSCs上Integrinα2、Notch1表达下调，且有密切的相互作用关系。因此拟进一步探讨Notch1调控Integrinα2影响成骨分化的分子机制及同OP的相关性，首先在人BMSCs成骨分化模型上采用了免疫共沉淀和激光共聚焦两种共定位方法分析它们的定位及关系，分化过程中的变化特点；进而在细胞及体内试验中分别上调或下调Notch1对Integrin α2活性的影响、信号通道相关分子的改变及对成骨分化能力的调节；我们引入邻位连接技术，检测Notch1调节Integrin α2下游复合体的机制；在骨质疏松患者BMSCs观察以上结构和通路在骨疏条件下的改变及意义；最后通过体内实验验证Notch1调控Integrin α2影响骨质疏松的机制。研究将阐明Notch1调节Integrin α2影响BMSCs成骨分化及骨质疏松的分子机制，并为药物研发提供新靶点。

骨质疏松症的病因包括：内分泌因素、遗传因素、营养因素、废用因素以及疾病及药物因素等。经典的理论认为骨组织内两种主要类型的成熟的骨细胞:成骨细胞(骨形成细胞)和破骨细胞(骨吸收细胞)[6]的核心功能是进行调节骨替代机制（骨重塑）来维护骨的完整性。然而,在骨质疏松期间增强的骨吸收和/或减少骨形成会导致骨量丢失。基于大量利用髂嵴活检进行组织形态学分析的研究发现,骨形成减少是年龄相关的骨量减少中主要的病理机制。在 Friedenstein 研究基础上,多数研究者认可骨髓间充质干细胞是骨细胞的重要来源，BMSCs 在体内分化受复杂的调控机制所控制，当调控机制发生紊乱，将会导致相关疾病的发生。BMSCs 成骨分化异常使得骨形成能力下降，这是导致骨质疏松的关键。相关研究表明 BMSCs 在骨质疏松患者骨髓中成骨分化能力减弱，成脂分化能力增加。 因此导致 BMSCs 骨形成能力改变的细胞和分子机制成为骨质疏松研究的热点问题。我们发现Notch1可以促进BMSCs的成骨分化中过程，进一步的分析还发现Integrin及其下游信号通路分子PINCH-1、FAK、ILK1的表达量及活性均有增加，这些下游信号又活化了LIMK及CFL，促进了细胞骨架结构的聚合。Integrin通过及下游信号活化的细胞骨架在Notch诱导的成骨分化有密切的作用关系。我们进一步抑制了Notch诱导的成骨分化Integrin活性后观察到成骨分化被明显抑制，同ERK信号失活可能与其具体机制有关。因此我们采用U0126对BMSC整合素α2高表达促进成骨分化的影响：分别以0、10、25μM/L浓度干预转染整合素诱导的BMSC成骨，观察其对成骨分化特异基因RUNX2及，茜素红染色的影响（方法同上）。我们发现转染后RUNX2及活化ERK可以被U0126抑制。进一步的分析也证明茜素红染色所体现的成骨分化也被 U0126 抑制本研究证实了Integrin在notch诱导的BMSC成骨分化中的意义，整合素表达缺陷导致的Notch/ERK/RUNX信号通路异常降低了BMSC成骨分化和增殖能力，在骨疏的发病中发挥了重要作用，为下一步开发骨质疏松治疗新药提供新的科研方向。