基于DNA条形码和1H-NMR代谢组学技术的多基源藏药小檗皮二维鉴定体系的构建

"XiaoBoPi" is a typical multi-species Tibetan medicine. A variety of Berberis plants are used as "XiaoBoPi" in China, which lead to uneven quality of the crude drugs. Therefore, it is highly desirable to establish an identification method that can fully reflect the "species authenticity" and "quality characteristics" of "XiaoBoPi". On the basis of preliminary studies, the purpose of this project is to establish a two-dimensional identification system that can simultaneously identify the "species" and "quality" of "XiaoBoPi" through the integrated use of molecular biology and metabolomics methods. That is, the objective and accurate DNA barcoding method will be applied to evaluate the ability of different barcode candidate sequence in the identification of the original plants and crude drugs of "XiaoBoPi", and to find out the most appropriate DNA barcodes. On the other hand, 1H NMR-based metabolomics protocol will be used for the qualitative and quantitative characterization of primary and secondary metabolites of "XiaoBoPi". The important points are to study the overall metabolites differences of different species, and to find out the key metabolic markers. Ultimately, the research results of the two methods are fully integrated to establish a two-dimensional identification system, which is not only able to provide reliable standards and technology platform for the accurate identification of the "species" and "quality" of "XiaoBoPi", but also to provide methodological reference for the quality control and quality evaluation of other multi-species Tibetan medicine.

藏药小檗皮为典型的多基源药材，品种繁多，来源复杂，导致药材质量参差不齐，因此亟需建立可全面反映药材"真伪"与"优劣"的鉴定方法。本项目拟在前期研究基础上，整合运用分子生物学和代谢组学研究方法，建立能同时表征小檗皮药材"品种"和"质量"的二维鉴定体系，即应用客观性强、准确性高的DNA条形码分子鉴定技术，评价不同条形码候选序列在小檗皮基源植物及药材（饮片）鉴定中的能力，筛选出药材鉴定最合适的DNA条形码片段（barcodes）。同时，应用体现整体性的氢核磁共振代谢组学技术，定性与定量表征小檗皮药材中的代谢成分，重点研究不同基源药材的整体代谢物组差异，发现种间差异特征代谢标志物（markers）。最终，将两种方法的研究结果进行整合，建立分子与化学成分联合的二维鉴定体系，为科学、准确地鉴定小檗皮的"基源"及"质量"提供可靠标准和技术平台，也为当前多基源藏药材的质量控制及评价提供方法学参考。

藏药小檗皮为典型的多基源药材，品种繁多，质量参差不齐，影响其质量控制及临床应用。基于此，本项目整合运用DNA条形码和1H-NMR代谢组学研究方法，建立了分子与化学成分结合的二维鉴定体系。采用DNA条形码研究方法，获得小檗皮4种主流基源品种（刺红珠Berberis dictyophylla、甘肃小檗Berberis kansuensis、鲜黄小檗Berberis diaphana、匙叶小檗Berberis vernae）的DNA条形码序列（ITS、ITS2和rbcL序列），筛选出小檗皮药材品种鉴定最合适的DNA条形码片段（barcodes）为rbcL序列，提供了一种鉴定小檗皮基源的试剂盒和方法，并成功应用于15批来自于藏医院、藏药厂的商品药材的品种鉴定。采用1H-NMR代谢组学方法，首次检测分析了小檗皮药材中整体化学成分组，建立了体现整体性的1H-NMR指纹图谱，结合化学计量学方法，首次从代谢物组水平上研究了小檗皮4种主流基源品种的初生和次生代谢产物差异，发现引起种间差异的特征化学标志物（markers）主要为小檗碱、巴马汀、药根碱、木兰花碱和蔗糖。此外，建立了同时测定小檗皮药材中4种有效成分（木兰花碱、药根碱、巴马汀、小檗碱）含量的HPLC方法，并参照现行版《中国药典》相关方法，首次建立了藏药小檗花、小檗皮及其复方制剂“吉尼德协”规范化的质量标准，包括水分和灰分检查、浸出物测定、显微和薄层鉴别、HPLC含量测定。本项目的研究结果为科学、准确地鉴定小檗皮药材的基源提供了可靠的技术平台，对于小檗皮药材的质量评控、品种鉴别及其开发利用有重要的指导作用，也为当前多基源藏药材的鉴定和质量评价提供了方法学参考。本项目取得了较好的研究成果，获得国家发明专利2项；发表学术论文13篇，其中SCI论文1篇，中文核心期刊论文6篇，中文一般期刊论文3篇，会议论文3篇；培养硕士研究生1人，本科生1人；相关研究成果获得中国民族医药学会/中国民族医药协会首届民族医药科学技术进步二等奖1项。