重组hMsrA穿膜活性蛋白对血管内皮功能的调节研究

血管壁氧化应激与动脉粥样硬化(As)的发生发展密切相关。氧化易使蛋白质中甲硫氨酸转为甲硫氨酸亚砜(MetO)，而细胞内存在的MetO还原酶A (MsrA)能特异催化MetO还原，成为细胞内一道特殊的抗蛋白氧化损伤的防御屏障。我们前期通过原核表达体系获得纯化的人MsrA（hMsrA），证实其能在细胞外直接修复氧化的脂蛋白并抑制氧化脂蛋白引起的内皮细胞凋亡，但外源MsrA难以直接进入细胞内成为限制其调节血管壁细胞抗氧化功能的关键环节。本课题拟借助新型高效运载体- - 细胞穿膜肽，构建pep-1-hMsrA重组蛋白，检测重组hMsrA进入血管内皮细胞的效率和调节细胞抗氧化的能力；进一步利用apoE基因敲除鼠，静脉输入pep-1-hMsrA，研究其对血管壁局部及整体氧还状态的调控及As斑块形成的干预作用，为开发防治As所致的冠心病、中风等心脑血管疾病的抗氧化生物技术药物提供新思路和技术策略。

提高机体组织细胞抗氧化能力的有效途径，对于动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)所致的冠心病、中风等重大心脑血管疾病的防治具有重要意义。本项目着重探讨细胞中特殊的抗氧化系统甲硫氨酸亚砜还原酶A (Methionine sulfoxide reductase A, MsrA)的调节功能，并利用新型高效运载体——细胞穿膜肽pep1将hMsrA导入细胞，尝试安全的、能特异增强细胞抗氧化防御能力、调控血管壁氧还状态的可行策略。本课题首先利用pET28a载体构建pET28a/pep-1-hMsrA和pET28a/hMsrA的原核表达系统，经诱导表达、亲和层析分别获得纯化的pep1-hMsrA与hMsrA蛋白，通过特异酶活性及CD光谱法鉴定，两者二级结构相似，活性无明显差异，说明pep1与hMsrA的融合蛋白对hMsrA的结构和功能活性无显著影响，同时，多种细胞水平实验证实了pep1-hMsrA蛋白的跨膜转导活性及细胞内的生物半衰期，并发现在ox-LDL处理的小鼠腹腔巨噬细胞中， pep1-hMsrA比hMsrA发挥更强的保护细胞作用。此外，进一步以apoE-/-小鼠为动物模型，可观察到静脉注射pep1-hMsrA较hMsrA发挥有效地抑制As进程的作用，在小鼠心脏组织中也检测到高量的pep1-hMsrA，在动物水平进一步证实了pep1-hMsrA的细胞膜穿透能力；比较小鼠主动脉斑块形成情况，显示pep1-hMsrA组注射小鼠的As形成略有减少，尤其在胸主动脉和腹主动脉部分差异有统计学意义。由以上结果我们认为hMsrA具有细胞抗氧化保护作用，与细胞穿膜肽pep1融合后的蛋白pep1-hMsrA能进入细胞内更好的发挥抗氧化保护作用，从而更为有效的抑制As的发生发展。