LOX-1在真菌性角膜炎抗真菌固有免疫中作用机制的研究

Fungal keratitis (FK) is a severe blinding disease. Innate immunity is the first line to defense against fungal infection of cornea, and pattern recognition receptors are the center of innate immune. This topic intend to analysis the role of lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor (LOX-1) and explore the influence of epigenetics in antifungal immunity of cornea by application of animal models with fungal keratitis. The signaling pathway is analyzed by the usages of antibody blocking, double-stranded RNA inference, overexpression, inhibitor, and by the methods of confocal microscopy, Western blot, ELISA, Real-time PCR, et al. Take several key targets of molecule signaling pathway, cytokines downstream and adhesion function as detection indicators and explore the relationships among LOX-1, NFκB, cytokines and chemokines and interaction of LOX-1 with TLR4 in innate immune. Determine the special significance of LOX-1 in the complex network. Observe the influence of LOX-1 in the course of fungal keratitis. Thus comprehensively study LOX-1-mediated innate immune in mechanism of fungal keratitis, so as to provide new idea for the treatment of fungal keratitis.

真菌性角膜炎是严重致盲性眼病。固有免疫是角膜抵抗真菌感染的第一道防线，模式识别受体是固有免疫的中心。本研究拟从动物模型的阻断实验、过表达实验以及FK患者及动物模型的表观遗传学等方面分析跨膜型模式识别受体LOX-1在人角膜抗真菌固有免疫的作用机制，通过Confocal显微镜、Western blot、ELISA、Real-time PCR等分子生物学手段等方法，以LOX-1、下游细胞因子以及粘附功能为评价指标，分析LOX-1与NFκB、细胞因子、趋化因子之间的关系以及与TLR4在固有免疫中的相互作用，分析LOX-1在角膜抗真菌固有免疫中的重要性，观察LOX-1对真菌性角膜炎病变过程的影响，论证LOX-1介导的固有免疫在真菌性角膜炎中的作用及机制，从而进一步深入研究真菌性角膜炎发病机制，为真菌性角膜炎的治疗提供新的思路。

1、项目背景：真菌性角膜炎是致盲率极高的感染性角膜病，药物和手术治疗效果不理想，寻找其关键的致病机制和治疗靶点是目前的研究难点。真菌致病力和机体免疫反应共同参与真菌性角膜炎的组织损伤，LOX-1作为模式识别受体参与这一进程。截止本项目开始前，LOX-1在真菌性角膜炎发病中的具体作用及机制尚未阐明。.2、主要研究内容：（1）以体外培养的人角膜上皮细胞为研究对象，检测角膜真菌感染后LOX-1的表达以及阻断LOX-1对下游细胞因子的表达、信号通路以及模式识别受体dectin-1、TLR4等的影响。（2）以真菌性角膜炎动物模型为研究对象，进一步探讨真菌性角膜炎动物模型中LOX-1的功能及其主要信号通路，研究LOX-1与TLR4、Dectin-1在真菌性角膜炎中的相互作用。（3）检测LOX-1对角膜真菌感染后中性粒细胞浸润和粘附、凋亡的影响。（4）以体外培养的人角膜上皮细胞和动物模型角膜为研究对象，糖皮质激素、免疫抑制剂预处理后，研究LOX-1、TLR4启动子甲基化程度及对下游炎症因子的影响，进而探究LOX-1、TLR4 DNA甲基化修饰对真菌性角膜炎调控机制。.3、重要结果：（1）在国内外首次证实阻断LOX-1显著降低人角膜上皮细胞真菌刺激后促炎因子表达。（2）角膜真菌感染后通过LOX-1、磷酸化p38MAPK信号通路影响下游细胞因子和中性粒细胞浸润。阻断LOX-1可降低TLR4 和IL-1β、ROS的产生，减少浸润中性粒细胞数量， LOX-1通过调控Fas、FasL、Caspase3，促进中性粒细胞凋亡，调控小鼠真菌性角膜中粘附因子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、P-selectin的表达。（4）糖皮质激素、免疫抑制剂可通过影响 LOX-1、TLR4 DNA甲基化进而影响真菌性角膜炎的免疫炎症反应进程。.4、科学意义：从体外细胞实验、动物模型实验及表观遗传学研究等多方面较为全面的论证模式识别受体LOX-1在真菌性角膜炎发病中的作用及机制，从LOX-1及固有免疫的角度进一步丰富了真菌性角膜炎致病机理的知识框架，并从理论研究的角度探索LOX-1及其相关信号通路节点作为药物作用靶点的可行性，从而为真菌性角膜炎的治疗提供了新的思路。