仙茅苷A促脑卒中后血管新生与CREB/EGR-3和PI3K/AKT信号通路相关的分子机制

Re-establishment of functional microvasculature promotes stroke recovery. Synaptic plasticity reflects the entire nervous system circuit how to react to external and internal stimuli. Curculigoside A is the major bioactive compound present in Curculigo orchioides. The primary results show that Curculigoside A protects brain against cerebral injury and promotes angiogenesis after stroke. Its promotion of angiogenesis might involve PI3K/AKT and CREB/EGR-3 signaling pathway. The objectives of this study are to determine the effects of Curculigoside A in a cultured HBMEC by vascular endothelial cell adhesion, proliferation, migration, tube formation and anti-apoptotic role in vitro and experimental ischemic stroke model in vivo. All experiments will elucidate whether PI3K/AKT and CREB/EGR-3 signaling pathway is directly related to its promotion of brain angiogenesis, and angiogenesis is directly related to its modulation of synaptic plasticity. These studies not only clarify Curculigoside A protects brain against cerebral injury and elucidates its molecular mechanism of angiogenesis, but also provides a theoretical basis to develop Curculigoside A as a first class new drug. In addition, it can offer cell and molecular screening system of cerebral ischemia.

血管新生是脑缺血后神经功能恢复的前提和基础，突触可塑性反映整个神经系统回路的对内外环境刺激发生改变的反应能力。我们前期研究结果显示仙茅苷A具有抗脑缺血和促脑缺血损伤大鼠脑血管新生作用，初步明确其促脑血管新生作用与PI3K/Akt/Bad和 VEGF/KDR/CREB/EGR-3/VCAM-1信号通路有关。本项目拟通过体内体外实验，研究仙茅苷A促血管内皮细胞黏附、增殖、迁移和抗凋亡作用以及促脑缺血大鼠血管新生过程是否PI3K/Akt/Bad和 VEGF/KDR/CREB/EGR-3/VCAM-1信号通路直接相关，以及促脑血管新生后是否诱导突触可塑性。上述研究既可阐明仙茅苷A促脑缺血损伤后大鼠血管新生的分子机制，为仙茅苷A开发为抗脑缺血损伤的一类新药提供理论依据，还可建立促进脑缺血后脑血管新生和诱导突触可塑性的细胞与分子筛选体系,服务于基于该作用机制的抗脑缺血药物的筛选。

血管新生是脑缺血后神经功能恢复的前提和基础。仙茅苷A为仙茅属植物仙茅的单体有效成分。通过制备纯化仙茅苷，开展人脑微血管内皮细胞细胞（HBMEC）毒性试验、增殖试验、划痕试验、成管试验及与CREB抑制剂KG-501，VEGF拮抗剂sFlt-1、受体阻滞剂SU1498、 EGR-3 siRNA合用，观察仙茅苷A对HBMEC毛细血管样结构形成；制备人HBMEC体外缺氧模型，观测细胞活力、Caspase-3活性及相关蛋白表达情况，ELISA法分析HBMEC体外培养相关蛋白表达。大鼠原代主动脉内皮细胞（RAEC）与平滑肌细胞（RASMC）共培养，观察毛细血管样结构形成及相关蛋白表达影响。制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观测缺血7和14天的BBB，分析缺血半暗带相关蛋白表达。结果提纯获得高纯度仙茅苷A10 g以上，满足了药理实验对样品的需求。仙茅苷A 3 μM以上诱导HBMEC和RASMC增殖，减少划痕直线间隔，促进HBMEC、RASMC与RAEC共培养毛细血管样结构形成；与CREB抑制剂KG-501，VEGF拮抗剂sFlt-1、受体阻滞剂SU1498、 EGR-3 siRNA合用降低毛细血管样结构形成；抑制体外HBMEC缺氧模型的细胞活力的降低，抑制凋亡发生；仙茅苷A 9 μM增加p-CREB，p-VEGFR2的表达，而且仙茅苷A 上调VEGF 依赖CREB。仙茅苷9 μM增加RASMC的Ang1，Wnt5a，β-catenin和Cyclin D1的表达，增加共培养RAEC和RASMC的 Ang1，VEGF，Tie2，Wnt5a，β-catenin和Cyclin D1的表达。仙茅苷A 10 mg/kg明显降低缺血7和14天的BBB；降低3，7，14天神经行为缺陷，增加缺血区VEGF，p-VEGFR2, CREB，p-CREB，Egr-3，VCAM-1和CD31表达。仙茅苷A促缺血后血管新生过程与VCAM-1/Egr-3/CREB/VEGF、Wnt5a/β-catenin及Ang1 /Tie-2信号通路直接相关。上述研究既可阐明仙茅苷A促脑缺血损伤后大鼠血管新生的分子机制，为仙茅苷A开发为抗脑缺血损伤的一类新药提供理论依据，还可建立促进脑缺血后脑血管新生的细胞与分子筛选体系,服务于基于该作用机制的抗脑缺血药物的筛选。