GSTM2基因无义介导的mRNA降解在猪胚胎生长发育过程中作用的分子机制

无义介导的mRNA降解（NMD）是清除机体内异常mRNA的重要机制，它能及时阻止对细胞具有潜在危害的截短蛋白的产生。猪谷胱甘肽S转移酶2（GSTM2）基因第5外显子C27T引发无义突变，形成了翻译提前终止密码子。我们在大白、梅山等猪种成年个体以及活仔猪（双亲为杂合型）中均未检测到TT基因型，而在流产猪中发现了TT基因型，这表明由于携带T等位基因的猪GSTM2 mRNA发生了NMD，缺失了GSTM2功能，从而极有可能导致猪胚胎的死亡或流产。本项目拟采用RNAi技术抑制GSTM2表达来离体模拟TT基因型个体，观察细胞生长过程中数量和形态等变化，并运用基因芯片技术研究相关基因的表达规律和网络关系，分析猪GSTM2基因NMD在猪胚胎生长发育过程中的作用机制，探讨其NMD现象与猪某种疾病的关系，以期为研究基因NMD现象与猪疾病的关系提供新的方法，为猪的分子抗病育种研究提供新的思路和可用的分子标记。

无义密码子介导的mRNA降解(NMD)是真核生物体内一种重要的mRNA质量监督机制。该机制能够特异性的识别和选择性的降解含有提前终止密码子的mRNA，防止具有潜在危害作用的截断蛋白的产生。谷胱甘肽-S-转移酶mu亚基对猪胚胎的着床具有调控作用而影响母猪的繁殖性能。研究发现猪GSTM2基因发生无义突变形成含有提前终止密码子的mRNA，使得GSTM2基因的mRNA发生了NMD现象，缺失了GSTM2的功能可能会导致猪胚胎的死亡或出生后夭折。为研究NMD现象在猪胚胎生长发育过程中的作用，本试验采用RNA干扰技术离体模拟GSTM2基因功能缺失，开展与之相关基因的转录组研究。我们设计合成了三对GSTM2基因的siRNA序列，并将三对siRNA片段转染猪睾丸细胞和猪肾细胞。经荧光检测后，猪肾细胞与猪睾丸细胞相比较具有较高的转染率。利用实时定量PCR在mRNA水平上检测GSTM2基因的表达量，结果显示GSTM2基因的表达量在猪睾丸细胞和猪肾细胞中都出现了显著的下调（p<0.01）。同时，结果显示在干扰24h后两种细胞内的GSTM2基因表达量达到最低。72h后猪睾丸细胞中GSTM2基因的表达量恢复至正常水平，而猪肾细胞中GSTM2基因的表达量没有恢复至正常水平； Western blot结果显示，在RNA干扰48h后猪睾丸细胞和猪肾细胞中GSTM2的蛋白表达量在都出现了明显的下降。基于以上实验结果，采用下一代测序技术进行RNA-Seq高通量测序，筛选了242个显著差异表达基因和156个显著富集通路，参与多个通路的基因主要是STAT1、SRC、DUSP家族、CCL家族、整合素相关基因及IL-8等。GSTM2可能是通过对参与GnRH通路的SRC有调节作用，影响激素的表达，对胚胎附植有影响；也可能是直接或间接通过其他方式对OPN、MUC4这些粘附分子有作用，从而影响子宫内膜表面的粘附分子，进而影响母-胎的成功结合。另外，GSTM2也可能在母-胎界面免疫方面发挥作用，对胚胎的识别过程中提高抵御能力；GSTM2也可能参与附植时期部分细胞的凋亡，在猪妊娠期，STAT1的表达受胚胎分泌的雌激素的影响，接着受IFNs的调控，它的高表达有抗增殖、促凋亡及促炎等作用。因此，GSTM2可能通过直接或间接对STAT1的调节来影响附植及胚胎与母体直接的互作。此外，并对参与上述通路的差异基因进行了q-PCR验证