p120-catenin调控巨噬细胞自噬在脓毒症中的作用及机制研究

Sepsis is a common clinical syndrome and treatment problem life-threatening in medical field. p120-catenin is a new member of catenin family, and plays an important role in inflammatory responses, cell proliferation and tumor invasion, and so on. Our previous study found that autophagy protein markers LC3-II were significantly increased following by knocked down p120-catenin in natural state or following by LPS-induced J774A.1 macrophages by making use of siRNA interference technology, and decreased the level of IL-18. Further study shows that p120-catenin can combine with upstream negative regulatory protein mTOR in autophagy signaling pathways. Therefore, we put forward to a hypothesis: p120-catenin could participate in the regulation of macrophages autophagy, and then affecting the process of sepsis. In the present study, making use of LPS induced macrophages and the cecal ligation and puncture established the model of sepsis, we detected the expression of TLR4/TRIF-mTOR, the immunofluorescence co-localization of mTOR and ULK1, the level of autophagy related gene ULK1, Atg5-Atg12-Atg16 and LC3-I/II, ROS, Caspase-1, IL-1β and IL-18 production via using RT-PCR, western blot, Co-IP, immunofluorescence confocal and transmission electron microscope, exploring the molecular mechanism of p120-catenin regulation of macrophage autophagy in sepsis, provide a new field for the immune prevention and treatment of sepsis.

脓毒症是重症医学领域常见的临床综合征和治疗难题。p120-catenin是新近发现的连环蛋白家族新成员，我们前期研究发现，利用siRNA沉默p120，巨噬细胞在自然状态和LPS诱导后自噬蛋白LC3-II表达均明显升高；IL-18产生显著降低，进一步研究发现，p120能与负调控蛋白mTOR相结合。为此我们提出假设：p120可能参与调控巨噬细胞自噬，进而影响脓毒症的进程。本课题拟通过LPS刺激巨噬细胞和盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型，观察p120基因敲除和过表达后巨噬细胞、脓毒症小鼠肝肺组织TLR4/TRIF-mTOR表达，p120与mTOR、ULK1免疫共定位，自噬相关基因ULK1、Atg5-atg12-atg16和LC3-I/II水平，活性氧ROS、Caspase-1、IL-1β和IL-18等产生，进一步阐明p120-catenin调控巨噬细胞自噬在脓毒症中的分子作用机制。

自噬是机体细胞通过溶酶体过程降解和再利用细胞蛋白的自我更新过程，对机体能量平衡和细胞内稳态至关重要。在机体感染过程中，自噬还可通过调节抗原呈递、淋巴细胞发育、炎性细胞因子产生、病原微生物包裹和清除，在天然免疫中发挥重要作用。研究表明，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）可诱导巨噬细胞自噬，在巨噬细胞炎性反应中发挥作用。p120连环蛋白是内皮细胞和其他极化贴壁细胞中贴壁连接的重要成分。在本课题中，我们利用LPS刺激J-774A.1、小鼠BMDMs巨噬细胞，诱导小鼠巨噬细胞自噬反应，利用基因沉默技术，通过Lipofectamine® RNAiMAX Reagent把p120siRNA成功导入到离体培养小鼠J-774巨噬细胞，在LPS诱导后，western blot 检测0.1 µg /ml LPS刺激后1h、2h和4h自噬蛋白标志物LC3-I/II的表达。以及0.05，0.1和0.2 µg /ml LPS刺激后4 h自噬蛋白标志物LC3-I/II的表达。表明p120基因沉默可致 LPS刺激后LC3-II表达明显降低，且呈时间和剂量依赖性。免疫荧光共聚焦显微技术检测具有相似的观察结果，免疫共沉淀结果显示p120可与LC3-I/II结合，而且LPS刺激后两者作用加强。免疫荧光共聚焦显微镜技术观察发现相似的结果，表明p120可能是自噬体的一部分，参与了自噬体形成。另外，我们利用0.1 µg/ml LPS刺激J-774巨噬细胞和p120-catenin基因缺陷型小鼠BMDMs细胞，采用Co-IP技术检测p120-catenin可与自噬信号通路负调控蛋白mTOR之间发生相互作用。以及mTOR与ULK1之间的的相互作用，p120-catenin基因缺陷对ULK1-FIP200-Atg13复合物稳定性影响，结果表明p120-catenin基因敲除增强了mTOR与ULK1之间的相互作用，但不干扰ULK1与FIP200-Atg13复合物的稳定性；p120 基因敲除也增强了LPS诱导的肺泡巨噬细胞p-ULK1(757)的磷酸化激活。p120通过激活自噬，进而抑制细胞凋亡的发生。我们利用GFP-p120转染J774A.1巨噬细胞，0.1μg/ml LPS诱导4h，结果发现LPS诱导后J774A.1巨噬细胞自噬明显增强，p120的过表达对LPS诱导的巨噬细胞自噬发挥促进作用；