Hispidin到桑黄素D的生物合成途径研究

Phelligridin D with stronger antioxidant effect, isolated from the fruiting body of medicinal fungus Phellinus igniarius, is the pigment constitute from hispidin derivatives synthesis. The variety of pigment compounds derive from hispidin. The pathway of hispidin biosynthesized from phenylalanine is clear, however, another biosynthetic pathway mediated by 4-hydroxy-6-methyl-2-pyrone may also exist in P. igniarius. Especially, the catalytic synthesis process from hispidin to phelligridin D is unknown. In our previous studies, the fungus of PI-NI-1 obtained from Phellinus igniarius through eliciting ways could produce hispidin and phelligridin D in it’s metabolites. Then, this project proposes to verify the reality of hispidin’s biosynthetic pathway from 4-hydroxy-6-methyl-2-pyrone according to the law of mass spectrometry cracking in phelligridins and the standard comparison by using isotope labeling precursor feeding techniques and HPLC-MS-MS dynamic flow monitoring means. At the same time, determine the biosynthesis from hispidin to phelligridin D and compare or contrast the content of phelligridin D before and after induction of P. igniarius whether correlate to the key enzymes. All above could provide important theoretical basis for the phelligridins biosynthesis and (half) synthetic study.

桑黄素D是野生桑黄子实体中由hispidin衍生合成的色素类成分，具有较强抗氧化作用。Hispidin是真菌代谢产物中多种色素类物质生合成前体。Hispidin的苯丙氨酸生合成途径已经比较清楚，但是在桑黄中，可能还存在4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮途径，尤其是hispidin如何经过下游催化生成桑黄素D的生源合成途径目前还不清楚。项目前期通过诱导桑黄基源菌种——火木层孔菌得到能够产生hispidin和桑黄素D的菌株PI-NI-1，故本项目通过同位素标记前体饲喂技术，采用HPLC-MS-MS动态流监测手段，根据桑黄素类成分质谱裂解规律及与标准品对照，验证hispidin的4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮途径是否存在，并确定从hispidin到桑黄素D的生物合成过程，比较火木层孔菌诱导前后关键酶活性的变化与桑黄素D含量之间是否具有相关性，为桑黄素类成分的生(半)合成研究提供重要的理论基础。

本项目通过同位素标记前体饲喂技术结合HPLC-DAD、HPLC-MS检测结果，验证以4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮做为关键前体合成hispidin的途径在火木层孔菌中确实存在。在PI-NI-1体系中，前体饲喂前体化合物4-羟基-6-甲基-吡喃酮后提取到顺反式结构hispidin；前体饲喂中间体化合物hispidin，PI-NI-1体系得到hispidin衍生物phelligridins A、C和D，并进行了结构鉴定；前体饲喂phelligridin D和hispidin，通过质谱检测到phelligridin G存在。利用正交试验极差分析法确定前体饲喂优化方法，对hispidin的产生进行定点追踪。在培养15天的发酵液中，投入底物终浓度为0.5 mg/mL的4-羟基-6-甲基-吡喃酮，hispidin产量为最高，通过时间点采样追踪，hispidin产量最高可达到44.38 mg/L。采用iTRAQ技术对前体饲喂后火木层孔菌菌丝体的蛋白质进行组学分析，并用MRM技术对iTRAQ数据进行选择特异性验证。iTRAQ分析结果显示前体饲喂4-羟基-6-甲基-吡喃酮后火木层孔菌的差异表达蛋白主要参与能量代谢、氧化磷酸化以及环境胁迫下产生的应激反应；MRM验证了从iTRAQ结果中筛选出的十一个蛋白，表达差异量基本一致，验证iTRAQ实验结果的准确性。根据蛋白质组学定量结果，差异蛋白GO富集分析和pathway富集分析，一共得到54个相关差异蛋白。差异表达蛋白主要集中为ATP合酶，NAD结合蛋白以及氧化还原酶，与hispidin及其衍生物合成过程中的电子转移，脱氢还原反应极为相关。Hispidin关键前体4-羟基-6-甲基-吡喃酮以及大量相关蛋白酶的发现，为深入揭示hispidin及其衍生物合成的分子机制，探索新的hispidin衍生物奠定基础。