钙内流驱动单个突触囊泡胞吐和胞吞机制的研究

Synapse is the structure basis for neural information processing. While synaptic vesicle is the information carrier, which fuses with the presynaptic membrane, causes transmitter release and mediates extremely rich neural information. Therefore, the kinetics of synaptic vesicle transmitter release is the important mechanism for information encoding. Related research has been the frontier in the field of neuroscience. The tight coupling between specific subtype calcium channels and vesicles fusion is a chanllenging and interesting issue. Due to the high-resolution problem of the technique for synaptic signal detection, there is rare report about the central nervous synaptic transmission with high precise. In this project, we adopt the synaptic transmission detection system based on the cell-attached membrane capacitance technique. With this high-precise system, we will detect the capacitance change cooresponding to the exocytosis and endocytosis of a single vesicle and single calcium current of the presynapse from calyx of Held in the central nervous system. We aim to study the temporal and spatial characteristics of cooresponding capacitance change and to explore the mechanism and the kinetics of calcium ions influx driven synaptic vesicle release and retrieval mode.

突触是神经信息处理的结构基础。突触囊泡是神经信息的载体，它与突触前膜的融合导致了神经递质释放，介导着极其丰富的神经信息。因此，突触囊泡递质释放动力学是神经信息编码的重要机制，相关研究一直是神经科学领域的前沿课题。钙离子内流驱动单个突触囊泡释放神经递质的动力学，以及不同亚型钙通道与囊泡的耦合关系是神经科学领域具有挑战性且引起广泛兴趣的重要问题。由于受突触信号检测技术的限制，高精度中枢神经突触传递的研究鲜有文献报道。本项目采用已建立的基于细胞贴附式膜电容技术的高精度突触信号检测系统，对中枢神经系统中Calyx突触单个囊泡胞吐和胞吞相关的膜电容变化和单通道钙离子电流进行动态检测，研究其时空特征，探索钙离子内流对突触囊泡释放与回收的模式及其动力学的作用机制。

囊泡自发释放电活动是大脑神经信息传递中普遍存在的一种电活动。近年来，研究人员发现囊泡自发释放电活动对神经突触生长、发育和维持及其可塑性和神经网络的建立有着重要的贡献。但是有关囊泡自发释放对Ca2+的依赖性以及其触发释放的机理目前尚不明确。研究人员曾在神经肌肉接头上实验，并用建模仿真技术推测，Ca2+可以通过一个或是两个电压门控的Ca2+通道（VGCC）介导的Ca2+内流可以触发单个囊泡释放。如果囊泡自发释放也由 VGCC 开放介导的Ca2+内流驱动，那么当我们阻断VGCC时，囊泡自发释放的频率应该相应地并实时地减少。本研究在出生后7-9 天野生型小鼠中阻断了VGCC8.5 min之后，囊泡的自发释放频率减少了大约40%，提示VGCC介导的Ca2+内流并不能直接地驱动囊泡自发释放。为了进一步研究VGCC介导的Ca2+内流是否能直接驱动囊泡自发释放，我们在calyx of Held突触上运用双膜片钳技术将记录到的数万个mEPSC和相应的突触前电流进行叠加平均，提高信噪比后结果显示，在mini发生的前几个毫秒至几十个毫秒的时间窗口内没有任何Ca2+内流的信号。这些结果提示，发育幼年期VGCC介导的Ca2+内流能调节囊泡自发释放频率，但并不直接地驱动囊泡自发释放。在研究囊泡的自发释放频率和细胞外Ca2+浓度的相关性时，我们发现囊泡自发释放对细胞外Ca2+的协同性比动作电位触发囊泡释放的相应协同性低，提示囊泡自发释放可能并非由囊泡快速释放的Ca2+感受器介导。为此，我们在特异性敲除 Synaptotagmin-2（Syt-2 KO）小鼠和野生型(WT)小鼠对calyx of Held突触以不同的细胞外Ca2+浓度进行mini的记录和分析，发现mini频率在KO和WT中对细胞外Ca2+浓度的依赖性不仅没有显著性差异，且拟合曲线所得到的Ca2+协同性参数非常相似。这些结果提示，在生理条件下，囊泡自发释放的Ca2+感受器不是Syt-2蛋白，而是其它一种或者多种具有较低的Ca2+协同性的蛋白。综上所述，我们首次在生理条件下，以直接的证据显示囊泡自发释放在calyx of Held 突触中不是由VGCC介导的Ca2+离子内流直接触发，并且进一步发现囊泡自发释放由Ca2+协同性较低的Ca2+传感蛋白驱动。