Endophilin-钙离子通道复合物在神经突触囊泡胞吞过程中的作用机制

我们已原创性地在神经元中发现Endophilin-钙离子通道复合物是一种新型的钙离子传感器，并证明了该传感器在神经突触囊泡回收中具有重要的生物学功能。然而，目前尚未明确这种钙离子传感器的作用机制。进一步的实验表明，突触囊泡胞吞辅助蛋白Dynamin与该传感器具有钙离子依赖性的相互作用；突触囊泡胞吞发生的同时可导致Endophilin从细胞膜上的钙离子通道上脱落。因此，我们对此新型钙离子传感器的作用机制提出如下假说：即神经元内钙离子浓度的改变直接影响到Endophilin的构象，从而对神经突触囊泡胞吞过程进行调控。本课题拟采用蛋白质相互作用技术、全细胞膜片钳电生理技术和荧光染色影像技术，获得钙离子对Endophilin构象及功能调节的可靠证据。本项目将阐明Endophilin-钙离子通道复合物在神经突触囊泡胞吞中的作用机制，为揭示钙离子在神经突触囊泡回收中的作用提供充分的科学依据。

Endophilin是细胞胞吞 (Endocytosis) 过程中的一种重要辅助蛋白，具有三种亚型，它们在神经元突触神经递质的回收过程中起着重要的调节作用。我们前期研究已证实endophilinII可以与钙离子通道蛋白的C末端形成复合物，且具有钙离子传感器的特点。本项目的研究目标即为阐明该复合物在神经元突触囊泡胞吞过程中的分子机理。通过分子生物学、电生理学及荧光染色等实验，我们发现：.1. 神经元内钙离子浓度的改变可以直接影响到endophilinII的构象，即在低钙离子浓度(100-300nM)时，endophilin 处于“开放”状态并可与dynamin(另一个重要的细胞胞吞相关蛋白)结合形成钙离子通道-endophilin-dynamin复合物；当神经元去极化，胞内钙离子浓度大于1μM时，endophilin可从“开放”状态变构为“闭合”状态，此时，钙离子通道-endophilin复合物解体，而dynamin也从endophilin上脱落下来，与endophilin一起调节突触囊泡的回收过程。.2. 除了早期研究发现的E264外，在endophilin SH3结构域内还存在另外三个钙离子结合位点。实验证实，三个新发现的钙离子结合位点，对endophilin的构象改变具有与E264相似的重要性。蛋白质晶体构象分析表明新发现的三个钙离子结合位点与E264在endophilin蛋白内可形成钙离子结合“口袋”。.3. I型与II型endophilin与dynamin的结合具有相似的特点，即endophilinI与dynamin结合也具有钙离子依赖性，而endophilinIII与dynamin的结合不具备钙离子依赖性。此结果提示大鼠大脑中不同的endophilin亚型对细胞胞吞过程具有不同的调节作用。.4. 在对endophilin磷酸化修饰研究中，我们意外发现，PKCε对神经元生长锥的生长具有调节作用。shRNA干扰大鼠海马神经元PKCε后，其生长锥能抵抗由PMA诱导的生长锥坍塌现象。初步研究表明，该现象可能是由ENH(PDLIM5)蛋白调控PKCε的活性所致。. 综上所述，本项目的实施科学地阐明了endophilin-钙离子通道复合物在神经突触囊泡胞吞过程中的分子作用机制，为开发新型神经系统药物提供了新的靶标。