大黄素介导VDAC促进中性粒细胞凋亡的机制研究诠释“以通为用”新内涵

Traditional Chinese medicine acknowledges “taking pass as use”. Modern medicine has also proved on both clinical practice and basic research that this theory can be used to guide the treatment of severe acute panceatitis (SAP) with Yangming fu-organ syndrome. However, the connotation of “taking pass as use” is far more than that. Recent researches have confirmed that emodin promotes apoptosis of neutrophils, which is related to the voltage-dependent anion channel (VDAC). This study aims to elucidate the molecular mechanism of emodin-mediated VDAC promoting apoptosis of neutrophils, interpretate the modern scientific connotation of “taking pass as use”, which can provide a new basis of integred medicine treatment of Yangming fu-organ disease. Based on SAP annimal model and HL60-derived neutrophils cell model, we confirm that emodin can modulate VDAC, and reverse validation would be applied by antibody blocking test. The molecular mechinism of emodin on VDAC is revealed by the assays of ChIP, MG132 and Ub antibody detection. After constucting phosphorylation mutation site of VDAC, we further investigate factors of VDAC activity. Finally, we detect neutrophils in peripheral blood of clinical SAP patients to validate the mechanism of emodin-mediated of VDAC to promote the neutrophils apoptosis.

中医认为“六腑以通为用”，现代医学已在临床实践和基础研究中证实此理论可用于治疗以阳明腑实为证候的重症急性胰腺炎(SAP)，但“以通为用”的内涵不仅如此。课题组前期发现大黄素促进中性粒细胞(PMN)凋亡的功能与线粒体外膜通道蛋白VDAC密切相关。本研究旨在阐明大黄素介导VDAC促进PMN凋亡的分子机制，诠释“以通为用”的现代科学内涵，为中西医结合治疗阳明腑实证提供新依据。首先，基于SAP阳明腑实证动物模型和维甲酸诱导HL60分化建立的PMN细胞模型，初探大黄素对VDAC的调控作用，并利用抗体阻断实验进行反向验证。然后，利用免疫共沉淀、蛋白酶体活性抑制实验和Ub抗体检测，在核酸和蛋白水平揭示大黄素调控VDAC的分子机制。通过构建磷酸化突变位点，进一步寻找VDAC活性影响因素。最后，以临床SAP患者PMN为研究对象，验证VDAC在大黄素介导PMN细胞凋亡过程中发挥的作用。

胰腺炎是临床上常见的急危重症之一，具有起病急、进展快、并发症多、病死率高等特点。重症急性胰腺炎急性反应期临床表现出的腹痛甚或拒按、腹胀、便秘、身热烦躁等痞满燥实坚的临床表现，用六经辨证可归属于典型阳明腑实证范畴。重症急性胰腺炎可发生瀑布样级联反应，可导致全身炎性反应综合征和多器官功能障碍综合征。传统医学认为大黄素具有泻火解毒、活血祛瘀、破徵瘕积聚、攻积导滞、推陈致新之功效。现代医学对于大黄素的药理药效研究表明大黄素具有泻下、抗菌、促进新陈代谢等功效。课题组即围绕大黄素作用于重症急性胰腺炎时中性粒细胞、免疫细胞、肠道屏障等机制研究，阐述中药以“通里攻下”之法治疗“阳明腑实证”的现代科学内涵。.本项目研究发现大黄素能上调中性粒细胞VDAC1基因和蛋白的表达，抑制活性氧生成，通过NLRP3炎性体信号通路减少炎症因子的和成熟释放，抑制炎症扩大。同时发现大黄素能减轻重症急性胰腺炎造成胰腺损伤、降低肠道通透性、上调肠道紧密连接蛋白的表达。大黄素改善重症急性胰腺炎肠屏障功能障碍的机制，可能由Bax/Bcl2/caspase3通路介导。此外，大黄素可以通过降低促炎细胞Th1、Th17、γδT细胞及其亚型的比值，增加抗炎细胞Th2细胞的比值而发挥全身性的免疫调节作用。为大黄作为疗效独特的中药品种治疗优势病种之重症急性胰腺炎提供了有力的实验佐证。.申请人及课题组在疫情干扰项目进程近一年的情况下，基于已有的研究成果在多次讨论后做出大胆尝试，通过中药药靶数据库的数据分析和公共数据库的数据挖掘，拓展了原有的研究方向。围绕胰腺疾病，申请人在中药干预的炎癌转化和癌炎疲乏的研究方向做出初步探索，发现了胰腺癌的潜在中药靶点。课题组将以此为基础继续开展中西医结合治疗胰腺疾病的机制研究。.项目利用现代科研技术，从动物、组织、细胞、通路、分子等多层面，解读中医“以通为用”理论的现代科学内涵，为中医“以通为用”理论结合现代医学临床诊治手段治疗重症急性胰腺炎提供了理论依据和实验基础。