不同形态申克孢子丝菌诱导角质形成细胞内吞和活化NLRP3炎性小体的作用及TLR4调控机制的研究

Sporothrichosis is a common dermatomycosis caused by the infection of Sporothrix schenckii (Ss.), a dimorphic fungus. Clinical analysis shows that the primary link of Ss. infection is the ability to invade the epidermal barrier constituted by keratinocytes. Recent studies have shown that keratinocytes response to the morphological transformation of biphasic fungi through endocytosing yeast. Our group found that Ss. can promote the expression of NLRP3, ASC and other inflammatory molecules in keratinocytes. TLR4 is an important receptor for the identification of Ss. which is also a key receptor for endocytosis and inflammatory response. It is hypothesized that keratinocytes may mediate endocytosis and regulate activation of inflammasome through TLR4 receptors to protect against Ss. First, in this project, we try to elucidate the regulation of internalization of keratinocytes induced by Ss. and explain the effect of dimorphic transition on internalization of keratinocytes introducing the invasion experiment, immunofluorescence, RNAi and other methods. Sencond, we investigate the mechanism of formation of NLRP3 inflammasome in keratinocytes activated by Ss.. Finally, we explain the regulation mechanism of TLR4 receptor in keratinocytes. this project will help to expand the understanding of keratinocytes in resisting infection of microbiology and provide science guidance for analyzing the mechanism of invasion of Ss.

孢子丝菌病是由双相真菌申克孢子丝菌（Ss.）感染引起的常见的皮肤真菌病。临床分析显示，能否侵袭由角质形成细胞构成表皮屏障，是决定Ss.感染的首要环节。最新研究显示，角质形成细胞可能通过内吞酵母细胞，以应对双相真菌的形态转换。我们发现Ss.可促进角质形成细胞NLRP3、ASC等炎性分子的表达。TLR4是识别Ss.的重要受体，同时亦是介导细胞内吞和炎症反应的关键受体。故此推测，角质形成细胞可能通过TLR4受体介导细胞内吞和调控炎性小体活化，以抵御Ss.的感染。本项目拟应用侵袭实验、免疫荧光标记、RNAi等方法，着力阐明Ss.诱导角质形成细胞内吞及侵袭的作用规律，明确Ss.激活角质形成细胞NLRP3炎性小体的作用机制，并进一步解析TLR4受体在角质形成细胞中的调控机制。本项目的完成将有助于拓展对角质形成细胞在抵御微生物感染的认识，为解析Ss.侵袭机体的作用机制提出科学依据。

孢子丝菌病是由双相真菌申克孢子丝菌（Ss.）感染引起的常见的皮肤真菌病。临床分析.显示，能否侵袭由角质形成细胞构成表皮屏障，是决定Ss.感染的首要环节，但目前缺少相关研究。我们的研究首次发现人角质形成细胞（Hacat）可以内吞申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii senus lato）酵母相和菌丝相（分生孢子），结果提示，在感染过程中申克孢子丝菌的双相型转换有助于进入机体内。而且两者可诱导Hacat细胞分泌抗菌肽（LL-37、hBD-1）、ROS、NO，其中酵母相表达量高于菌丝相，结果表明酵母相更易于刺激机体产生免疫反应；通过比较酵母相和菌丝相胞外蛋白酶活性显示，菌丝相胞外蛋白酶活性显著高于酵母相，而且通过比较两者对Hacat细胞的杀伤作用发现，菌丝相对Hacat的杀伤效率高于酵母相，这表明在感染过程中菌丝相的侵袭性强于酵母相，提示环境中的申克孢子丝菌菌更易于发生感染；酵母相和菌丝相可以活化Hacat细胞NLRP3炎症小体和IL-1β、IL-18表达，其中NLRP3分子表达显著升高，并且酵母相活化能力更强，表明在申克孢子丝菌感染Hacat细胞时，可以通过活化NLRP3炎症小体，促进炎症分子的表达。IL-1β、IL-18、ROS、NO的表达与NLRP3的调控有关，但不能调控对抗菌肽的表达；TLR2表达受抑制时，酵母相和菌丝与Hacat细胞共孵育后，Hacat细胞的内吞效率显著降低，表明TLR2是Hacat细胞介导内吞的重要识别受体。而且TLR2 敲减后，酵母相和菌丝相诱导细胞表达NLRP3炎症小体的水平明显下降，细胞因子IFN-γ、IL-6和IL-1β以及LL-37、hBD-1、ROS、NO浓度均显著降低。表明申克孢子丝菌活化Hacat细胞NLRP3炎症小体以及分泌细胞因子是由TLR2所介导的。本项目的完成阐明了角质形成细胞对不同形态申克孢子丝菌内吞作用的规律；明确不同形态申克孢子丝菌侵袭角质形成细胞的规律；解析不同形态申克孢子丝菌激活角质形成细胞NLRP3炎症小体的作用机制；揭示TLR2在申克孢子丝菌感染角质形成细胞诱导细胞内吞和活化NLRP3炎症小体的调控机制。